薄层色谱知识干货分享

文/ 狐佳骏

掌握薄层色谱法必备的基础知识// 色谱法起源于20世纪初，经过无数科学家一百多年的创新与完善，现已成为应用广泛的分离分析技术，尤其是薄层色谱法，在化药合成、医药中间体合成领域意义重大。本文集中介绍了一些薄层色谱法的基础知识及使用过程中的注意事项。

薄层色谱英文名称为Thin- Layer Chromatography ， 简写 为TLC。将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板（如玻璃板、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25 毫米左右）后，在此薄层板上进行层析分离的分析方法。它具有分析速度快、灵敏度高、选择性高、试样预处理简单、所用仪器简单等特点。

基本原理

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力的不同，使流动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分互相分离的目的。

相关参数

1.比移值 Rf

从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。除另有规定外，杂质检查时，各杂质斑点的比移值在0.2~0.8之间为宜；最佳范围为0.3~0.5。

2.相对比移值 Rs

各组分Rf值之差。各组分比移值之差最好控制在0.05，可以消除一些实验过程中的系统误差，以防斑点重叠（注：系统误差可控，偶然误差不可控，具体可参考《分析化学》）。

3.影响因素

固定相、流动相种类及性质、展开剂饱和度、温度、薄层板的性质等，在完全相同的条件下某一成分的比移值为固定值。

用具及操作

薄层板

1.按固定相种分类：硅胶、三氧化二铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树等，注意所选固定相必须不与流动相及被分离化合物反应。

2.按效率分类：普通板，粒径为10~40 um(200~500目)； 高效板，粒径为5 um（500~1000目）；

3.常用硅胶板分类：硅胶H—不含粘合剂；硅胶G—含煅石膏粘合剂；硅胶HF254—含荧光物质，可用于波长为254 nm紫外光下观察；荧光硅胶GF254—既含煅石膏又含荧光剂。

薄层板的制备及注意事项

1.手工铺板：将1份固定相和3份水或加有黏合剂的水溶液（如0.2%~0.5%羟甲基纤维素钠水溶液）或为规定浓度的改性剂溶液，在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2~0.3 mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘箱中烘30分钟，随即置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，可在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑， 并且无麻点、无气泡、无破损及污染。

2.活化目的：去除固定相表面多余的水分，保证及加强粘合剂的粘度。相当于人体内水：自由水在细胞内、细胞之间、生物体内可以输送新陈代谢所需营养物质和代谢的废物；结合水在生物体内或细胞内与蛋白质、多糖等物质相结合，失去流动性。结合水是细胞结构的重要组成成分，不能溶解其他物质，不参与代谢作用。与人体中的水一样，活化的目的相当于去除多余的自由水，如果温度过高就会破坏结合水，使其结构受到破坏，降低粘合剂的粘度。所以，一定要注意活化的温度。

3.活化效果评判依据：此法仅做参考。以正己烷：乙酸乙酯（9:1）为展开剂，以偶染料即苏丹红和对氨基偶氮苯混合样，计算两者比移值，见表1。

表1 苏丹红和对氨基偶氮苯混合样的比移值

4.贮存：保存于相对干燥的环境中（干燥器） 备用，市售硅胶板用前需干燥半小时，聚酰胺薄膜不需干燥。

5.注意事项：检查所选板种类、完整度、清洁度、尺寸，以及铺板时所选固定相，在满足实验结果前提下，也可根据固定相价格、吸附剂选择。

展开缸

展开缸类型有双底展开槽、普通展开槽、水平展开槽。由于展开槽价格昂贵，在使用时注意爱护保养，用完后及时清洗。

展开剂

展开剂可以为一种溶剂，也可为多种溶剂，当一种溶剂不能很好的展开各组份时，常选择混合溶剂作为展开剂，先用极性小的为基础，再用极性大的混合，逐次实验。比移值太大，降低展开剂极性；比移值太小，增大展开剂极性。对于极性小的样，选择活性强的吸附剂，极性小的展开剂，反之则性状正好相反，例如，环己烷：丙酮：二乙胺：水（10:5:2:5），其中丙酮降低粘度,二乙胺调节pH,环己烷降低水的极性，使比移值降低。常用的展开剂有水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、苯、 甲苯、环己烷、石油醚（极性从大到小大小排列），展开剂选择的影响因素有被分离试样组分的极性、吸附剂活性、展开剂极性。

各溶剂在展开剂中的作用：极性强的溶剂可以使化合物在薄层板上移动；

极性弱的溶剂能降低极性强的溶剂的洗脱能力和比移值；

一般中等极性的溶剂能够使极性强的和极性弱的溶剂混合均匀；

在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度。用黏度太大的溶剂时，往往需要加入一种溶剂，以降低展开剂的粘度，加快展开速度。

在配制展开剂的时候，要选择正确的溶剂，精密量取，根据配比混合均匀，注意分层的展开剂中上下层溶剂的选择，现用现配（混合溶剂中溶剂挥发性不同），配量不宜太多。

点样工具及点样

一般为圆点状或窄细的条带状，色样基线距底边10~15 mm ,高效板一般基线距底边8~10 mm，圆点状直径一般不大于4 mm，高效板一般不大于2 mm。接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为5~10 mm，高效板条带宽度一般为4~8 mm, 可用专用半自动或全自动点样仪点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8 mm，高效板供试品间隔不少于5 mm。常见的点样工具有毛细管、自动点样器、微量注射器。

点样操作时要注意，点样量要小、划线要轻薄、点样时轻、记录清楚、重复点样时要等前一次的点样溶剂挥发后再进行下一次的点样，总之原则为尽量小的点样面积、尽量高的样品浓度、点样速度要快。

展开操作及注意事项

展开方式包括上行、下行、近水平展开三种。

1.上行展开：将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5 mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8~15 cm，效薄层板上行展开5~8 cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测；

2.下行展开：多用于纸色谱中。将点样后的滤纸悬放于展开剂槽中，用玻璃棒加以固定，下方可放入饱和滤纸所用的溶剂，展开剂从上向下展开。此法除了毛细管作用外还有重力作用，因此展开速度比上行展开速度快；

3.近水平展开：将适量溶剂置于长方形的玻璃展开槽中，将点样后的薄层板下端浸于展开剂 0.5 cm处，并与水平成5~10角，适用于不含粘合剂的软板展开。

4.注意事项：等样品中试剂挥发完后再进行展开，展开时台面要平整，不能倾斜。必要时，可进行二次展开，进行第二次展开前，应使薄层板残留的展开剂完全挥发。展开缸上做好标记，以防混淆。注意展开过程中展开缸的密封性。垫高展开缸一端，一方面节省展开剂，另一方面使展开剂更集中，提高展开效果。

薄层色谱的应用

薄层色谱的主要应用有定性分析、定量分析、紫外分光光度法、波层扫描色谱法、鉴别，以及反应进程跟踪（原点是否消失，多用于化药合成、医药中间体合成等）