补肾强筋胶囊含药血清对骨关节炎滑膜细胞、软骨细胞PGE2、NGF基因表达的影响

陈 能，姚 楠

（1.广州中医药大学第二临床医学院骨科，广东 广州 510120；2.广州中医药大学第二附属医院/广东省中医院珠海医院骨科，广东 珠海 519000；3.广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种发生在膝关节的退行性疾病，病理表现为滑膜炎性增生，软骨退变等，临床表现为膝关节疼痛、活动受限等。既往已有多项动物及细胞实验证实KOA的发生发展受多种细胞因子影响，其中基质金属蛋白酶（Matrix Metallo Proteinase，MMP）在KOA关节软骨的破坏中起主要作用；前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）是炎性致痛因子；环氧合酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）是催化PG的合成的诱导酶，并参与了KOA炎症反应；神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）与神经病理性疼痛及炎性疼痛均有关［1-2］。本研究观察补肾强筋胶囊含药学清对KOA滑膜细胞、软骨细胞MMP13、PGE2、COX-2、NGF基因表达的影响，探讨治疗KOA的作用机制［3］。

1 研究对象及分组

选取在广东省第二中医院骨科住院的拟行全膝关节置换手术的KOA患者。西医诊断参照中华医学会风湿病学分会2010年制定的膝关节骨性关节炎诊断标准［4］。

2 手术取材

术中取出病变滑膜组织，在完成股骨远端截骨后取出股骨髁软骨，软骨厚度不小于1 mm，尽快转移至实验室。

3 实验材料

主要实验仪器：SmartSpec plus 核酸蛋白测定仪（Bio-Rad公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司），IQTM5型RT-qPCR仪（Bio-Rad公司）。

药物和试剂：补肾强筋胶囊（广东省第二中医院制剂室）；重组人IL-1β试剂（Peprotech公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（Thermo Fisher Scientific公司）；PCR特异性引物（上海英潍捷基贸易有限公司）。

4 实验方法

原代滑膜细胞培养。滑膜组织剪切碎放入培养皿中，DPBS溶液清洗弃上清液后加0.25%胰酶1 mL，静置于37℃，5%CO2培养箱60 min，取出弃胰酶，加入10%FBS的DMEM 2mL，然后静置于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞生长达瓶底90%以上后，用0.25%胰酶进行消化传代，然后继续用10%FBS的DMEM培养。

原代软骨细胞培养。软骨组织剪切成碎块放入培养皿，DPBS溶液清洗弃上清液后加入0.25%胰酶1mL，静置于37℃，5%CO2培养箱30min，然后弃上清液，加入0.02%II型胶原酶，静置于37℃，5%CO2培养箱内过夜后，用100µm滤网过滤，加入10%FBS的DMEM，1600rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用10%FBS的DMEM培养，待细胞生长达瓶底90%以上后，用0.25%胰酶消化传代，然后继续用10%FBS的DMEM培养［5-7］。

含药血清制备［5-7］。SPF级别SD雌性大鼠10只，体质量为180～220g。把大鼠分成空白组、含药血清组，每组5只。根据动物与人之间药物剂量换算，补肾强筋组每1kg予以0.243g生药补肾强筋胶囊溶液灌胃，空白组予生理盐水灌胃。所有大鼠连续7天每天灌胃1次，然后行腹主动脉取血，然后按3000rpm离心5min，弃上清液，56℃水浴30min灭活，经0.45µm滤膜抽滤，分装，置于-80℃冰箱保存，即为空白血清和含药血清。

细胞造模及分组［4］。将第3代细胞按每孔1×105个细胞密度种植于6孔板（n=6），培养至融合度约达80%时，弃培养基，用DPBS清洗后，进行分组处理。正常组为DMEM培养基+10%空白血清；OA组为DMEM培养基+10%空白血清，加入50ng/mL IL-1β；含药血清组为DMEM培养基+10%含药血清，加入50ng/mL IL-1β。连续培养24h后收集细胞。

RT-qPCR检测细胞PGE2、COX-2、NGF、MMP-13的基因表达。首先采用Trigol、异丙醇和氯仿等试剂提取滑膜细胞、软骨细胞总RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit提供的实验方法进行反转录操作，加入上述提取的总RNA，合成First-Strand cDNA。基因引物设计利用Primer6.0生物软件。然后在定量PCR仪进行扩增和熔解曲线分析，反应结束后记录Ct值，运用2-△△Ct法分析各组基因相对表达量。

5 结 果

滑膜细胞基因表达比较。与OA组比较，正常组、含药血清组PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，含药血清组PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组滑膜细胞因子基因表达比较 （n=6，±s）

表1 各组滑膜细胞因子基因表达比较 （n=6，±s）

注：与OA组比较，*P＜0.05；与正常组比较，△P＜0.05。

组别 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常组 1.00±0.40*1.00±0.42*1.00±0.40*1.00±0.44*OA组 5.36±1.81 4.59±0.99 4.32±0.81 6.43±1.79含药血清组2.42±0.39*△2.53±0.40*△2.36±0.56*△ 2.87±0.73*△

软骨细胞基因表达比较。与OA组比较，正常组、含药血清组PGE2、COX-2、、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（P＜0.05），与正常组比较，含药血清组PGE2、COX-2、、MMP-13基因表达比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组软骨细胞NGF表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组软骨细胞因子基因表达比较 （n=6，±s）

表2 各组软骨细胞因子基因表达比较 （n=6，±s）

注：与OA组比较，*P＜0.05；与正常组比较，△P＜0.05。

组别 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常组 1.00±0.33*1.00±0.13 1.00±0.29*1.00±0.34*OA组 3.21±1.10 1.03±0.30 7.48±2.15 3.61±0.91含药血清组1.56±0.33*△1.21±0.44 3.32±0.79*△2.06±0.53*△

6 讨 论

正常状态下，膝关节滑膜可产生滑液，滑液主要发挥润滑关节腔及吞噬物质的作用，软骨由软骨细胞、纤维和细胞外基质构成，细胞外基质能保护软骨细胞使其不与关节腔直接接触。KOA发生时，关节滑膜发生炎症反应，释放出炎性介质、细胞因子等物质［8］，使膝关节腔内环境处于炎性状态，导致软骨细胞外基质持续性地发生降解，当达到一定程度时软骨细胞暴露于炎性环境中，使软骨细胞逐渐失去活性，甚至死亡，最终软骨破损。此外，KOA关节腔内物质中不乏多种致痛因子，这些因子刺激神经感受器，引起了疼痛［9-10］。研究表明，KOA膝关节滑膜、软骨中一些细胞因子水平的升高影响了病情，王培等［11］研究表明COX-2mRNA在膝关节骨性关节炎病变初期滑膜细胞中表达水平较高。StoppielloLA等［12］发现KOA患者膝关节滑膜中NGF的表达升高，且与疼痛相关，而PecchiE等［13］研究采用炎性因子刺激软骨细胞时，也会使NGF表达升高。本研究使用重组人IL-1β刺激复制滑膜细胞和软骨细胞OA模型，结果表明上述因子基因表达确实有不同程度的升高，这与以往研究结果相符。

KOA属中医“痹证”范畴。潘建科等［14］通过数据挖掘分析表明具有补肾、活血功效的中药是治疗KOA内服处方的主要成分。补肾强筋胶囊由补益肝肾、活血通络中药组成，既能补肝肾之不足以滋养筋骨，也能通局部之淤阻以顺畅气血，从而发挥缓解膝关节疼痛，改善关节活动功能的功效。研究表明，补肾强筋胶囊能有效改善膝关节滑液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平以及血清PGE2水平［15］，补肾强筋胶囊含药血清可显著降低软骨细胞上清液NO和PGE2水平，并显著降低软骨细胞COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表达［5］。研究对该药治疗KOA的作用机制进行了补充，结果表明补肾强筋胶囊含药血清对滑膜细胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF基因表达，对软骨细胞PGE2、COX-2、MMP-13基因表达均有一定程度调节作用，但对于软骨细胞NGF基因表达无明显调节作用。

因此，补肾强筋胶囊治疗KOA的作用可能与调节滑膜细胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF以及软骨细胞PGE2、COX-2、MMP-13的基因表达有关。对于滑膜细胞，研究使用重组人IL-1β刺激，可使NGF基因表达显著升高，而采用含药血清干预能使NGF基因表达显著下调，但对于软骨细胞，无论用采取何种干预方式对NGF基因表达均无明显调节作用。研究表明，膝关节滑膜中神经分布更为密集，但关节软骨无神经支配，由于NGF分布可能与神经分布有关，因此软骨细胞NGF基因表达未发生显著变化［16］。