复合酶法提取蛹虫草类胡萝卜素工艺优化及其抗氧化能力测定

周翔宇，樊桂灵，邓扬龙，李玉锋

（西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039）

类胡萝卜素是一类由类异戊二烯单位组成的碳氢化合物及其氧化衍生物的总称[1]，绝大多数的类胡萝卜素都是脂溶性色素[2]。按照类胡萝卜素是否含有氧元素可将其分为两大类：一类是只含有碳氢元素的类胡萝卜素：如β-胡萝卜素、番茄红素等；另一类是含有氧元素的胡萝卜素：叶黄素、玉米黄质等。类胡萝卜素具有很多功能特性，有研究[3]发现其具有抗炎、抗癌、抗氧化、预防AMD(老年黄斑变性)疾病等功效，除此之外，其还具有良好的着色效果，因而广泛应用于食品和医药行业当中[4−5]。但是，由于类胡萝卜素的脂溶特性导致其存在不利于人体消化吸收、生物利用度不高等问题。针对这一问题目前已有许多学者做出了相关方面的努力，王思元等[6]就类胡萝卜素的稳态性技术进行了综述。

蛹虫草即北冬虫夏草，是一种药食两用的真菌且其是目前报道的所有大型食药用真菌中类胡萝卜素含量最多的真菌[7]。2013 年高燕燕等[8]对蛹虫草菌丝体色素进行鉴定，鉴定结果显示其为类胡萝卜素，之后又对其稳定性进行了探究。紧接着Dong 等[9]对蛹虫草类胡萝卜素的结构进行近一步的分离鉴定，其乙醇提取液的质谱结果显示该色素含有4 种水溶性极强的结构，分别为Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxathin-Ⅱ、Cordyxathin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ。相比之下，有关其生物活性的研究较少，张明亮等[10]通过体外试验对蛹虫草类胡萝卜素提取物进行活性初步探究。之后朱振元等[11]对其色素提取物进行了抗氧化活性检测。目前，已有一些学者对于蛹虫草类胡萝卜素的提取工艺进行了研究。张志军等[12]采用酸热提取法对蛹虫草子实体当中的类胡萝卜素进行提取并通过正交试验进行提取优化，提取率可达到2 158 μg/g。娄海伟等[13]利用响应面试验设计优化超声辅助乙醇提取类胡萝卜素的工艺条件，优化之后类胡萝卜素的提取率可达637 μg/g。这两种提取方法均存在耗能大、提取效率不够高等问题。与传统溶剂法以及超声微波法相比酶辅助提取法具有自己的优势，酶辅助提取法的原理主要是利用生物酶破坏细胞壁结构从而将色素较温和且带有选择性地释放出来[14]，生物酶的专一性保证其不会对底物外物质造成破坏，这一特性使酶辅助提取法更适合于提取稳定性较差且含量较低的化学成分[15−16]。2019 年国内学者汪建红[17]利用木瓜蛋白酶辅助提取荸荠当中的色素，高效的获得荸荠色素且其稳定性较高。除此之外，采用酶辅助提取法相对于其他常规溶剂提取法拥有更多的优点，提取过程对环境十分友好，提取效率更高，对提取设备及环境的要求更低且能耗低，开展性较强适应于工业化生产[18]。采用酶辅助提取法提取色素有许多优势，但单一的酶可能不能满足要求，所以有的研究者尝试用两种以上的酶采用复合酶提取法提取色素。2019 年国外学者Gizem 等[19]采用纤维素酶和果胶酶共同作用提取土豆废弃基质中的番茄红素并对其提取工艺进行了优化。

本文参照文献[19]的方法拟以蛹虫草子实体为原料采用纤维素酶和果胶酶2 种复合酶共同作用提取蛹虫草类胡萝卜素并通过单因素和响应面试验优化其提取条件，同时采用紫外光谱法初步分析鉴定其组成结构并测定其总抗氧化能力。旨在为蛹虫草类胡萝卜素这一新型色素[20]的工业化大批量生产提供理论指导，同时也增加了蛹虫草这一真菌的附加值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所使用的原材料蛹虫草新鲜子实体均由四川省巴中市南江宏信生物有限公司提供，其中该蛹虫草子实体的培养基为小麦培养基。

1.2 实验试剂与设备

实验试剂：食品级纤维素酶（山东省临沂市圣斯德样品厂）；食品级果胶酶（宁夏和氏璧生物技术有限公司）；分析纯无水乙醇（成都市科隆化学品有限公司）；分析纯丙酮（成都市科龙化工试剂厂）；分析纯二氯甲烷（成都市科龙化工试剂厂）；分析纯盐酸（成都市科龙化工试剂厂）；乙腈（HPLC≧99.9%，美 国Sigma 公 司）；甲 醇（HPLC≧99.9%，美 国Sigma 公司）；分析纯二甲亚砜（成都市科龙化工试剂厂）；β-胡萝卜素标准品（HPLC≧96%，化夏试剂）。

实验设备：BT-423S 型分析天平（赛多利斯科学仪器(北京)有限公司）；ZN-200A 高速中药粉碎机（长沙市岳麓区中南制药机械厂）；SHA-B 振荡水浴锅（常州市金坛华伟仪器厂）；精密鼓风干燥箱（上海恒一科学仪器有限公司）；移液枪（艾本德中国有限公司）；药典筛（浙江上虞市道墟化验仪器设备厂）；RE-52A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Molecular Devices SpectraMaxi3X 多功能酶标仪（美谷分子仪器(上海)有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原料粉末的制备

样品制备的方法参照邵颖等[21]的方法并进行改进。新鲜蛹虫草子实体于60 ℃下烘干至恒重，粉碎过60 目筛，低温干燥避光条件下密封保存备用。

1.3.2 提取溶剂的确定

为使得样品定量测定时溶剂体系与标准品保持一致，以便用酶标仪直接测定样品提取液吸光度时直接定量。本实验以溶解度为表征，参照Dong 等[9]的方法用乙醇溶液对色素粗提物进行溶解度试验，结果显示其在体积分数为60%以下的乙醇溶液中具有良好的溶解性。再选择丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜（DMSO）、乙腈、60%乙醇溶液和丙酮与60%体积分数的乙醇混合溶液（2∶1）作为研究对象，将蛹虫草子实体色素粗提物分别溶解于上述7 种溶剂中，最终通过颜色辨别判断其溶解性从而确定最佳提取溶剂。结果显示丙酮和60%体积分数的乙醇混合溶液（2∶1）能够溶解标准品β-类胡萝卜素，同时蛹虫草子实体当中的类胡萝卜素在其中能够很好地提取出来，因而最终确定本试验开展的提取溶剂为丙酮和60%体积分数的乙醇混合溶液，两者的比例为2∶1，在此条件下提取得率最高，为2 256 μg/g。

1.3.3 复合酶的选择以及添加比例的确定

蛹虫草类胡萝卜素为胞内色素，所以需要先破坏细胞壁然后才能使色素很好地释放出来。由于细胞壁是由纤维素和果胶构成的，所以本试验拟采用纤维素酶和果胶酶两种酶共同作用以裂解细胞壁从而提取色素。为探究纤维素酶和果胶酶的最佳复合比例，本实验选取了纤维素酶∶果胶酶（1∶2）；纤维素酶∶果胶酶（2∶1）；纤维素酶∶果胶酶（1∶1）三种方案进行预实验，预实验结果以提取溶液的吸光值来表征，结果显示复合酶比例为纤维素酶∶果胶酶（2∶1）条件下，吸光值可达到3.322，而其余两种条件下吸光值分别为2.355（纤维素酶∶果胶酶=1∶2），2.985（纤维素酶∶果胶酶=1∶1），因此本实验选择纤维素酶和果胶酶按照2∶1 的比例进行复合。

1.3.4 β-胡萝卜素标准曲线方程的建立

由于目前暂无蛹虫草类胡萝卜素标准品，所以本实验中蛹虫草类胡萝卜素的定量测定是参照Dong 等[9]的方法，并在其方法的基础上进行改进。首先将预实验得到的蛹虫草类胡萝卜素粗提物用丙酮和60%体积分数乙醇水溶液（按2∶1）比例配制而成并溶解，经酶标仪在380～600 nm 波长范围内进行光谱扫描分析，之后确定本实验的样品溶液的最大吸收峰在445 nm 处，以便提取之后对类胡萝卜素进行定量。配制标准曲线时，精确称取0.05 mg β-胡萝卜素标准品，加入50 μL 二氯甲烷试剂使之溶解，之后也用丙酮和60%体积分数乙醇混合溶液（比例=2∶1）定容到10 mL。从配置好的母液（c=5 μg/mL）中分别吸取4、5、6、7、8 mL，用丙酮和60%乙醇的混合溶液定容至10 mL，再用酶标仪在445 nm 下测定不同浓度β-胡萝卜素溶液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准β-胡萝卜素溶液浓度为横坐标，作标准曲线，标准曲线图见下图2。

线性回归方程：

式中：x，β-类胡萝卜素的浓度，μg/mL；y，吸光值。

类胡萝卜素含量计算公式：

式中：c，β-类胡萝卜素的含量，μg/g；V，丙酮和60%乙醇混合液体积，mL；m，粉末样品质量，g。

1.3.5 复合酶法提取蛹虫草类胡萝卜素

新鲜蛹虫草子实体在60 ℃烘干至恒重，粉碎过60 目筛备用。称取蛹虫草粉末2 g，加入20 mL 丙酮和60%体积分数乙醇混合溶液（体积比=2∶1）以及复合酶并调溶液的pH 至所需，将混合液置于恒温水浴中酶解一定时间，4 500 r/min 离心10 min，将上清液稀释100 倍，并准确吸取200 μL 置于96 孔板中，用酶标仪在445 nm 波长条件下扫描测定提取液的吸光度值，根据标准曲线方程从而得到蛹虫草类胡萝卜素的提取得率。其中蛹虫草类胡萝卜素含量的计算方法见公式（2）。

1.3.6 复合酶法的单因素实验

酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：新鲜蛹虫草子实体在60 ℃烘干至恒重，粉碎过60 目筛备用。分别称取5 份2 g 的原料粉末置于5 个已编好号的锥形瓶中，然后分别加入丙酮和60%体积分数乙醇混合溶液（体积比=2∶1）20 mL 和复合酶，其中纤维素酶与果胶酶的混合酶添加量为0.5%，纤维素酶和果胶酶的添加比例按照预实验结果最佳比例2∶1 添加，调至pH 为4，之后将5 个锥形瓶分别置于温度为20、30、40、50、60 ℃的5 个恒温水浴锅中进行酶解提取，酶解时间为50 min，4 500 r/min 离心10 min，将上清液稀释100 倍，并准确吸取200 μL 置于96 孔板中，用酶标仪在445 nm 波长条件下扫描测定提取液的吸光度值，由标准曲线方程得到蛹虫草类胡萝卜素的提取得率。

pH 对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他实验条件不变的基础上，探究pH=3、4、5、6、7 对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同上面式（1）中所述。

酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他实验条件不变的基础上，探究酶解时间=20、30、40、50、60 min 对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同（1）。

酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他实验条件不变的基础上，探究酶浓度（质量分数）=0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同式（1）。

1.3.7 复合酶法的响应面工艺优化试验

根据上面单因素实验结果，根据Box-Behnken实验设计原理，选取酶解pH、酶解温度、酶解时间3 个因素为响应因素，以蛹虫草类胡萝卜素的提取率为响应值，共设计17 个实验点开展响应面实验分析，实验设计与结果见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.3.8 蛹虫草类胡萝卜素粗提物的纯化

根据单因素和响应面实验共同确定提取最佳工艺条件，之后对最佳工艺条件下提取得到的色素进行纯化处理。方法如下：称取蛹虫草子实体粉末2 g，溶剂添加量为20 mL，调节提取体系的pH 为4，复合酶的添加比例为0.5%，酶解时间45 min，酶解温度50 ℃，在以上条件下提取获得色素提取上清液。将色素上清液上样于HP-20 大孔树脂吸附柱充分吸附，大孔树脂吸附柱事先用去离子水洗涤去杂质并调节其为中性，之后，用60%乙醇解吸附，洗脱液即为蛹虫草类胡萝卜色素纯化液。之后将洗脱液置于旋转蒸发仪上减压浓缩至浸膏状，之后在超低温冰箱中冷藏过夜再放置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得蛹虫草类胡萝卜提纯物干品，之后避光低温保藏备用。

1.3.9 蛹虫草类胡萝卜素总抗氧化能力测定

机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。本实验采用比色法测定提取色素的总抗氧化活力，对比测定两种提取方法下获得的蛹虫草类胡萝卜素纯化物的总抗氧化活性。其中试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，测定步骤按照试剂盒说明书具体开展。

1.3.10 数据分析方法

采用Design-Expert 10.0 软件进行响应面实验设计与分析，每组实验重复3 次，采用IBM SPSS Statistics 软件处理数据，采用Origin8 软件进行绘图分析。

1.3.11 验证性实验

按照上面1.3.1 中实验原料的处理方法制备原料粉末，根据响应面实验设计的最佳工艺条件进行实验，测定该工艺条件下的蛹虫草类胡萝卜素的提取率。

1.3.12 方法对照实验

为证明复合酶解法提取色素的高效性，本文拟选取张志军等[12]的酸热提取法的最佳工艺条件作为对照，酸热提取法的工艺条件如下：取1 g蛹虫草子实体样品粉末加入1 mol/L 盐酸15 mL，室温下浸泡20 min，在沸水浴当中处理4 min 之后迅速冷却，3 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清液，将沉淀用蒸馏水洗涤2 次后加20 mL 丙酮，室温下振荡30 min 浸提类胡萝卜素，然后在4 000 r/min 条件下离心15 min 得上清液即为类胡萝卜素浸提液之后按照式（2）的定量方法进行测定。最后将酸热提取法的实验结果同上面1.3.11 当中验证性实验结果作对比。

2 结果与分析

2.1 样品测定扫描波长确定

将预先准备的样品采用酶标仪在380～600 nm 波长范围内进行紫外-可见光光谱扫描，类胡萝卜素由于其中的共轭双键体系形成的光吸收载色体，除了使其有特殊的颜色外还有特征的吸收光谱，它可作为类胡萝卜素进行初步鉴定的依据[22]。扫描结果见图1，光谱扫描图呈明显的三指特征峰，表示本实验提取出的蛹虫草色素提取物属于类胡萝卜素物质，这为实验的进一步开展提供了理论支撑。除此之外，出现三指特征吸收峰的位置分别在420、445、475 nm 处。其中，本实验中采用的原料蛹虫草的类胡萝卜素提取物在445 nm 处有最大的吸收峰，因此蛹虫草类胡萝卜素提取物的定量测定，扫描波长设定在445 nm。

图1 蛹虫草类胡萝卜素粗提物的光谱扫描图

2.2 提取溶剂的确定

通过溶解性实验判断，比较乙醇体积分数在0～100%范围内，色素粗提物的溶解性。最终确定乙醇体积分数为60%条件下色素提取物的溶解性最佳，该结果与Dong 等[9]的实验结果保持一致，其在不同体积分数的乙醇溶液中的溶解性对照图结果图2，其中色素溶液的质量浓度为1 mg/mL；其中色素粗提取在不同溶剂体系中的溶解结果图3，色素浓度为0.3 mg/mL。图3 从左至右溶剂体系分别为：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO（二甲亚砜）、丙酮与60%乙醇溶液（2∶1）、60%乙醇溶液，根据颜色深浅以及溶解程度的判断，最终确定复合酶共同作用提取蛹虫草子实体色素的最佳提取溶剂为丙酮与60%乙醇混合溶液，其中两者的混合比例为丙酮体积∶60%乙醇体积=2∶1。

图2 不同质量分数乙醇溶液中色素的溶解性

图3 不同溶剂体系中色素的溶解性

2.3 β-胡萝卜素标准曲线的绘制

以β-胡萝卜素质量浓度为横坐标（μg/mL），其吸光度值为纵坐标绘制标准工作曲线，得到β-胡萝卜素的标准工作曲线如图4 所示。线性回归方程为y=0.1093x+0.0801，相关系数R2为0.999 2，说明β-胡萝卜素质量浓度在2～5 μg/mL 范围内与其吸光度值呈良好的线性关系。

图4 β-类胡萝卜素标准曲线

2.4 单因素实验结果

2.4.1 酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

保持其他提取条件一致，提取pH=4，提取时间为50 min，复合酶添加浓度为0.5%，料液比为1∶10，通过单因素实验来考查温度对于提取率的影响，结果见图5。结果显示，试验初期随着提取温度的上升，蛹虫草类胡萝卜素的提取率呈现上升的趋势。其中，当提取温度提高到50 ℃时，提取率最高，达到3 082.34 μg/g；但是，当提取温度继续增加到60 ℃时，提取率骤降，但仍旧高于其他几个温度下的提取率。分析其原因为当提取温度上升到60 ℃时，高温使复合酶失去活性，因而提取率会有所降低；另外，60 ℃高温可能会造成蛹虫草类胡萝卜素结构损伤分解，致使其提取效果降低[23]。

图5 酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

2.4.2 pH 对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

控制复合酶协助提取蛹虫草类胡萝卜素的其他提取条件一致，分别为:提取时间50 min，提取温度50 ℃，复合酶的添加浓度0.5%，料液比为1∶10。探究pH 为3、4、5、6、7 等5 种条件下，类胡萝卜素的提取率的变化。图6 结果显示，提取体系的pH 对于提取率具有显著的影响。从图6 可以看出，当pH 增加到4 时，提取率达到最大值，为2 249.77 μg/g，继续增加提取体系pH，提取率反而呈现下降的趋势。这主要是因为酸性条件下有利于蛹虫草子实体细胞壁的降解从而更有利于色素的溶出，但是当提取环境过酸时会对色素分子本身结构造成一定的破坏[24]，从而导致提取率呈现降低的趋势。

图6 pH 对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

2.4.3 酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

保持其他提取条件一致的基础上，即提取温度为50 ℃，pH 为4、酶的添加浓度0.5%（质量分数），探究不同的酶解时间：20、30、40、50、60 min 下提取率的变化情况。从图7 可以看出，在时间范围为20～50 min 时，提取率与提取时间呈正相关性，但是，当提取时间延长到60 min 时，酶解的效果反而会降低。导致这种结果的原因是因为反应时间过长溶液中的色素堆积过多，这会对酶促反应带来抑制作用且类胡萝卜素暴露在细胞外时间过长易被破坏和氧化。

图7 酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

2.4.4 酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

在其他酶解条件一致的基础上，探究酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响作用。本实验设置5 个酶浓度（质量分数），分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，保持其他提取条件一致的基础上，即提取温度为50 ℃，pH 为4、酶解的时间为50 min，探究不同的酶浓度对提取效果的影响，实验结果见图8。由图8 结果可以看出，酶的添加浓度对于酶解效果的影响不是特别显著，其中提取率最低值为2 667.12 μg/g，最高值达2 909.79 μg/g。由图8可知酶浓度在0.2%～0.5%时，提取率与酶浓度呈正相关的趋势，当继续增加酶的浓度到0.6%时，提取率反而有所降低，降到2 898.64 μg/g。这是因为0.5%的酶添加量已经足够整个反应体系中蛹虫草子实体粉末的细胞壁破裂，酶的浓度过大不能够增加反应底物的数量，因而提取率不会有明显变化。

图8 酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

2.5 响应面实验结果

为优化复合酶共同作用提取蛹虫草当中的类胡萝卜素的工艺条件，根据上面单因素实验开展的结果，选取pH、酶解时间、酶解温度3 个因素为响应面实验的3 因素，设定为3 水平，分别为pH=3、4、5；酶解温度为40、50、60 ℃；酶解时间为40、50、60 min，根据Box-Behnken 试验设计原理共设计17 个实验点，以提取率为响应值开展试验。其中，响应面的实验设计与结果见表2，回归方程方差分析结果见表3；各因素间相关性试验结果见图9、图10、图11。

图9 pH 与酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

图10 pH 与酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

图11 酶解时间与酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归方程方差分析结果

由表2 的实验组合和结果进行分析得到表3的显著性和方差分析表，采用Design-expert 10.0 软件对实验数据进行多项式回归分析，经拟合分析得到综合得率Y对自变量A、B、C的回归方程：Y=3.74−0.36A−0.37B+0.18C+0.27AB−0.014AC−0.13BC−0.69A2−0.52B2−0.30C2。该模型的相关系数R2=0.985 2，P＜0.000 1，表示该试验模型极度显著。通过软件求解回归方程，得到蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取条件为：提取pH=3.8、酶解时间为43.62 min、酶解温度为52.41 ℃，在该提取条件下提取到的蛹虫草类胡萝卜素理论上可达到3 888.34 μg/g。由表2 响应面分析实验方差分析结果可知该模型P＜0.01，说明该实验回归模型达到极度显著水平。除此之外，失拟项P=0.592 7＞0.05，表明该拟合方程能够很好的说明实验结果。通过表中各因素来源的方差分析可以得到显著性检验结果，模型一次项中pH、酶解时间、酶解温度都是极显著的，在二次项中A2、B2、C2也是极显著的，在交互作用影响当中只有pH 和酶解时间的交互是显著的。另外，根据一次项系数的绝对值可以看出各因素对蛹虫草类胡萝卜素提取得率的影响主次顺序为：酶解时间＞酶解pH＞酶解温度。由图9 可知，当固定酶解温度探究pH 与酶解时间的交互作用时，等高线图呈现明显椭圆状，表明pH 与酶解时间的交互作用十分明显。另外，响应曲面结果表明蛹虫草类胡萝卜素的提取率随着pH 和酶解时间的增加呈先上升后迅速下降的趋势，其中当pH=4、酶解时间为50 min 时，提取率达到最大。由图10 可知，当固定酶解时间探究pH 与酶解温度之间的交互作用时，等高线中心部分呈现圆形，表明两种单因素之间的交互作用不显著。另外，响应曲面的走向也呈现先上升后缓慢下降的趋势，可能是因为pH 和酶解温度过高影响酶的活力，从而导致提取率的降低。由图11 可知，pH 不变的情况下，酶解时间和酶解温度之间的交互作用，由等高线图可以看出是不太显著的但是仍然有很强的相关性，响应曲面结果分析可以得出随着酶解时间和酶解温度的增加，提取率的变化呈先上升后下降的趋势，可能是因为酶解温度和时间在一定范围内达到最高值时，酶的活性会降低从而影响到提取率，另外提取时间过长色素堆积过多也会对酶促反应造成抑制。

2.6 色素粗提液纯化结果

将按照单因素和响应面实验得到的最佳提取工艺提取的蛹虫草子类胡萝卜素粗提液经过大孔树脂吸附纯化，之后经旋转浓缩干燥和真空冷冻干燥得到蛹虫草类胡萝卜素纯化物。将纯化物精确称重，其产量为0.021 g（2 g 原料粉末），得率为1.05%（即1.05 g/100 g 干品）。

2.7 验证性实验结果

对响应拟合的方程通过软件求解回归方程，得到蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取条件为：提取pH=3.8、酶解时间为43.62 min 酶解温度为52.41 ℃。考虑到实际操作的可行性，将提取条件设定为pH=4，酶解时间为45 min，酶解温度为50 ℃，在此条件下开展提取实验，提取到的蛹虫草类胡萝卜素含量为3 796.23 μg/g，与理论预测值相近，偏差较低，说明该回归方程曲线能够很真实地反应各单因素对于蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响同时也验证了用该模型来筛选提取蛹虫草类胡萝卜素的最佳工艺条件是可行的。

2.8 方法对照实验结果

目前对于蛹虫草类胡萝卜素提取方法较为认可的是酸热提取法，本试验按照张志军等[11]的提取最佳工艺开展方法对比试验。酸热提取法的实验结果显示蛹虫草类胡萝卜素的提取率可达3 163.54 μg/g，与复合酶提取法提取得率3 796.23 μg/g 相比明显较低且可操作性低于复合酶解法，验证了复合酶解法的高效性也肯定了本文研究的意义。

2.9 总抗氧化活力测定结果

总抗氧化能力用活力单位来表征，活力单位定义如下：在 37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白，使反应体系的吸光度（OD 值），每增加 0.01 时，为一个总抗氧化能力单位。通过试剂盒实验然后测定反应液在520 nm 下测定的吸光值，通过计算公式计算出其总抗氧化活力，计算公式如下：

式中：A表示总抗氧化能力，U/mg；B1 表示测定OD 值；B2 表示对照OD 值；C1 表示反应液总量，mL；C2 表示取样量，mL；D表示提取液蛋白浓度，mg prot/mL。

通过上面公式计算得出两种提取条件下得到的色素纯化液的总抗氧化能力结果见表4。由表4可知，复合酶解处理提取得到的类胡萝卜素和酸热提取条件下得到的类胡萝卜素，在使用相等色素纯化物含量条件下分别测定两者的总抗氧化能力，其中经复合酶法提取得到的类胡萝卜素总抗氧化能力可达4.151 U/mg，酸热处理提取得到的类胡萝卜素总抗氧化能力为4.096 U/mg。两种提取方法下获得的类胡萝卜素总抗氧化能力相当，因而证明采用复合酶共同作用提取蛹虫草类胡萝卜素，不影响其色素的总抗氧化能力。

表4 复合酶解处理对蛹虫草类胡萝卜素总抗氧化能力的影响

3 结论

本研究采用纤维素酶和果胶酶复合酶共同作用，通过开展单因素试验和响应面试验来优化复合酶解法辅助提取蛹虫草子实体当中类胡萝卜素的最佳提取工艺条件，即:pH=4，酶解时间45 min，酶解温度50 ℃，酶浓度为0.5%，在此提取条件下，蛹虫草类胡萝卜素的提取率可达到3 796.23 μg/g，显著高于酸热提取法下的提取率（3 163.54 μg/g）。另外，两种提取方法下得到的蛹虫草类胡萝卜素的总抗氧化能力相差不大。通过紫外光谱分析对色素提取液进行初步鉴定，结果其分别在420、445、475 nm 波长下有明显吸收峰，符合类胡萝卜素的特征。本实验的开展为蛹虫草类胡萝卜素的提取提供一种更加高效环保的方法，该方法更适于大规模工业生产。但是，目前尚未开展该提取方法下所得到的色素的纯化以及其功能活性方面的相关研究，这也将是本试验后续研究的一大方向。