促愈熏洗方促进肛瘘术后大鼠肛门部创面修复效果及机制探究

瞿 胤，张志君，芦亚峰，郑 德，陆 宏，杨 巍

(上海中医药大学附属曙光医院，上海201202)

肛门直肠瘘简称肛瘘，是指肛门周围的脓肿溃破或切口引流引起的病变，与脓肿是同一种疾病的两个阶段[1-2]。肛瘘临床表现为流脓、疼痛、瘙痒等局部症状，且反复发作，严重影响患者身心健康和生活质量[3-4]。目前，治疗手段主要以手术为主，但术后也存在创面愈合周期长的难题。中医外敷药物治疗疮疡由来已久[5]。大量临床数据表明，促愈熏洗方对于肛瘘术后的创面修复有良好的疗效[6-7]。陈刚等[8]构建全层皮肤缺损模型大鼠，发现促愈熏洗方可抑制炎症因子水平，促进创面的愈合，但其具体作用机制尚不完全清楚。研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号通路在创面愈合、瘢痕形成过程中有重要作用[9]。基于此，本研究将从TGF-β1/Smad3信号通路方面，探究促愈熏洗方在肛瘘术后创面大鼠模型中的创面修复效果及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康SD大鼠，雄性，清洁级，6～8周龄，体重(200±20)g，由上海实验动物研究中心提供，动物许可证号SCXK(沪)2019-0005。每日更换饲料，自由摄食饮水，室温22～24 ℃，相对湿度40%～60%。

1.1.2 药物制备：促愈熏洗方由蒲公英、苦参、 当归、虎杖和五倍子组成：蒲公英、虎杖各30 g，五倍子15 g，苦参、当归各9 g，用水煎煮2次，3 h/次，第1次10倍量水，第2次为5倍量水，去渣存液。

1.1.3 主要试剂与仪器：高锰酸钾(吉林省东盟制药)，ELISA试剂盒(南京森贝伽)，蛋白抗体(美国Abcam)；激光多普勒血流仪(英国Moor Instruments)，多功能酶标仪(美国Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：40只大鼠随机分为对照组、肛瘘模型组、促愈熏洗方组和高锰酸钾组(阳性对照)，每组10只。各组大鼠分笼饲养，适应性喂养7 d。

1.2.2 造模与处理：参照文献采用综合法建立肛瘘术后创面大鼠模型[10]，腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉大鼠，剃除肛门部手术区毛发备皮并消毒，于肛管旁作直径2.5 cm圆形皮肤伤口，同时切开肛管，伤口深达肌肉层约0.3 cm，止血后在创面加1 ml粪液，并用油纱、敷料和胶带固定48 h，若伤口有脓性分泌物、粪臭味，提示造模成功。对照组大鼠制作相同的肛门部肌层伤口，但不敷粪液。促愈熏洗方组取药剂以1∶4稀释后擦洗大鼠创面，纱布包扎，2次/d。高锰酸钾组以1∶5000稀释后擦洗创面，纱布包扎，2次/d。对照组和模型组以生理盐水擦洗，纱布包扎，2次/d。各组大鼠均连续干预14 d。

1.2.3 创面观察及局部血流监测：于术后3 d和药物干预结束后，采用透明格子胶片测量局部创面面积，创面愈合率=(原始创面面积术后3 d-当前创面面积药物干预结束)/原始创面面积术后3 d×100%。应用激光多普勒血流仪，记录随机3处创面血流情况，并经Power Lab Chart数据采集分析系统计算3处创面血流值，取均值为最终结果。

1.2.4 新生毛细血管数检测：药物干预结束后，取大鼠肛管相近处的肉芽组织，经甲醛固定后制成石蜡切片，进行免疫组化染色，以CD31抗体标记新生毛细血管，200倍镜下计数棕色新生毛细血管数。

1.2.5 血管生长相关因子和炎症因子检测：药物干预结束后，取大鼠肛管相近处的肉芽组织，匀浆分离上清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，操作严格参照ELISA 试剂盒说明，检测血管生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)、胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1，IGF-1R)、血小板源生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)、白细胞介素及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.6 TGF-β1/Smad3信号通路蛋白表达检测：药物干预结束后，取大鼠肛管相近处的肉芽组织，加入RIPA裂解液匀浆提取蛋白，各组取等量蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶分离，转膜后置于脱脂牛奶中封闭2 h，再加入各目的蛋白一抗(TGF-β1 1∶1500、Smad3 1∶1000、p-Smad3 1∶1000)，4 ℃孵育过夜，次日加入相应的蛋白二抗(1∶8000)，室温下孵育1 h，最后暗室曝光扫描条带，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠创面情况比较 见表1。与对照组比较，肛瘘模型组创面愈合率、局部血流量和新生毛细血管数均降低(P<0.05)；与肛瘘模型组比较，促愈熏洗方组和高锰酸钾组创面愈合率、局部血流量和新生毛细血管数均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方组高于高锰酸钾组(P<0.05)。

表1 各组大鼠创面情况比较

2.2 各组大鼠肉芽组织血管相关生长因子水平比较 见表2。与对照组比较，肛瘘模型组肉芽组织中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表达均降低(P<0.05)；与肛瘘模型组比较，促愈熏洗方组和高锰酸钾组VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表达均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方组高于高锰酸钾组(P<0.05)。

表2 各组大鼠肉芽组织血管相关生长因子水平比较

2.3 各组大鼠肉芽组织炎症因子水平比较 见表3。与对照组比较，肛瘘模型组肉芽组织中IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表达均升高(P<0.05)；与肛瘘模型组比较，促愈熏洗方组和高锰酸钾组IL-6、IL-12、IL-1β 及TNF-α表达均降低(P<0.05)，且促愈熏洗方组低于高锰酸钾组(P<0.05)。

表3 各组大鼠肉芽组织炎症因子水平比较

2.4 各组大鼠肉芽组织TGF-β1/Smad3信号通路表达比较 见表4(图1)。与对照组比较，肛瘘模型组肉芽组织中TGF-β1、p-Smad3/Smad3表达均下调(P<0.05)；与肛瘘模型组比较，促愈熏洗方组和高锰酸钾组TGF-β1、p-Smad3/Smad3表达均上调(P<0.05)，且促愈熏洗方组高于高锰酸钾组(P<0.05)。

表4 各组大鼠肉芽组织TGF-β1/Smad3信号通路表达比较

A：对照组；B：肛瘘模型组；C：促愈熏洗方组；

3 讨 论

由于肛瘘术后创口为开放性创口，容易被粪便污染，延长创口愈合时间，部分患者愈合时间可能超过4周。目前对于创面愈合延迟的机制研究较多，普遍认为创面的反复污染引起的持续性炎症反应，不利于细胞增殖和组织重塑[11]。因此，减轻炎症反应刺激，促进肛周组织细胞增殖，是促进肛瘘术后创口愈合的重要因素。本研究采用综合法建立肛瘘术后创面大鼠模型，符合临床病理特点[12]。

中医认为，肛瘘是肛痈溃后余毒结滞，或脏腑素虚，复感外邪，腑气壅阻，化腐成脓而成[13]。促愈熏洗方由蒲公英、苦参、 当归、虎杖和五倍子组成，方中以苦参为君药，有清热燥湿之效，臣以虎杖、蒲公英祛风利湿、清热解毒，佐以当归补血活血，五倍子收湿敛疮，诸药合用共奏清热燥湿、活血化瘀之功，可针对肛瘘术后创面修复的治疗。《医学流源论》[14]中记载“外科之法最重外治”，表明外治法是中医治疗皮肤创面类疾病的重要方法。本研究结果显示，促愈熏洗方可明显加速模型大鼠创面的愈合，与既往临床研究成果相符[15]。

炎症反应与创口血运在创面愈合中占据重要地位。创面愈合过程中，中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞会浸润至损伤部位，分泌合成大量炎性因子IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α等，爆发级联式炎症反应，接着进入创伤修复的细胞增殖和组织重塑阶段，而血管新生是这一阶段的关键[16-17]。VEGF、PDGF、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等是创伤后愈合最重要的生长因子，而Ang-Ⅱ在创伤后病理性血管生成中有重要的促进作用[18-19]。本研究结果显示，肛瘘模型大鼠创口局部血流量和新生毛细血管数减少，肉芽组织中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表达降低，IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表达升高，经促愈熏洗方治疗后上述指标明显改善，表明促愈熏洗方可降低炎症因子水平，减轻创面损伤，还可促进血管生长相关因子，加快创面局部血运重建，为组织修复提供营养条件。

TGF-β1被认为是成纤维细胞的强效趋化因子，不仅可调节细胞外基质蛋白合成和降解，还可刺激肉芽组织的形成[20]。创口愈合过程中，TGF-β1可活化TGF-β1受体激酶的底物Smad3，将TGF-β1传递至核内直接作用于DNA，调节靶基因的转录[21]。本研究中，肛瘘模型大鼠肉芽组织中TGF-β1/Smad3活性明显受到抑制，经促愈熏洗方治疗后TGF-β1/Smad3上调，提示促愈熏洗方可能通过TGF-β1/Smad3信号通路，促进细胞增殖，加速创面的愈合。

综上所述，促愈熏洗方可有效促进肛瘘术后创面大鼠模型的创面愈合，改善局部血流，可能与通过活化TGF-β1/Smad3信号通路，促进血管生长相关因子表达，抑制炎症因子表达有关。但促愈熏洗方是否有其他途径促进大鼠肛门部创面愈合，还需要大量实验进一步探究，以期为促愈熏洗方的临床应用提供科学数据支撑。