质子转移反应-飞行时间质谱快速鉴别金线莲产地

张金伟, 何聿， 邱彬， 李小晶, 张丹丹， 余文涛， 林振宇

(1. 福州大学食品安全与生物分析教育部重点实验室， 福建省食品安全分析与检测技术重点实验室， 福建 福州 350108；2. 福州大学环境与资源学院， 福建 福州 350108; 3. 福州海关技术中心， 福建 福州 350001;4. 福州商学院， 福建 福州 350001)

0 引言

金线莲是兰科开唇兰属植物， 不耐寒， 喜温暖湿润， 故主要生长于亚热带季风气候区域， 如福建、 台湾、 广西、 云南等地[1]. 金线莲具有“药王”的美称， 具有清热解毒， 凉血除湿， 降血压的功效[2]. 近年来， 科研工作者们利用不同检测手段对不同产地金线莲的主要成分及含量进行了检测， 实验结果表明， 福建金线莲的药用有效成分明显高于其他产地金线莲[3-7]. 这也导致有不法商人通过乱标产地， 以次充优来谋取暴利， 严重损害消费者的利益. 因此很有必要建立一种不同产地金线莲的快速鉴定手段.

目前中药材成分的检测和鉴定手段主要有气相色谱法[8]、 液相色谱[9-10]、 气相质谱-质谱联用法[11]、 液相色谱-质谱联用法[12]等. 但这些方法前处理繁琐、 耗时长、 且样品不可回收， 而质子传递反应飞行时间质谱仪则可以解决以上问题.

质子转移反应-飞行时间质谱(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)是近几年迅速发展的痕量挥发性有机物检测技术， 由Werner Lindinger 及其课题组成员结合化学电离源技术与流动漂移管模型技术于20世纪90年代首次提出[13]. PTR-MS具有快速、 灵敏度高、 无需样品前处理、 操作简单等优点， 可以实现挥发性有机化合物(volatile organic compounds， VOCs)的实时在线监测， 目前已被广泛应用于环境检测[14]、 医疗诊断[15]、 大气监测[16]、 食品科学[17]等各领域. 2016年， Acierno V课题组[18]采用PTR-TOF-MS对不同品种、 产地、 品牌的巧克力进行挥发性成分的指纹图谱收集， 并建立数学识别模型. 2018年， Farneti课题组[19]利用PTR-TOF-MS对苹果的香气成分进行了分析. Nikolaos等[20]使用PTR-MS鉴别了纯正藏红花、 掺假藏红花以及市场上低质量的藏红花.

本研究首次将PTR-TOF-MS应用于不同产地金线莲的快速鉴定. 通过对不同产地金线莲进行香气指纹图谱检测， 并结合化学计量学建立数学识别模型， 以建立一种快速、 准确、 便捷的金线莲不同产地快速鉴定方法.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

PTR-TOF-MS1000质子转移反应飞行时间质谱仪(奥地利 Ionicon 有限公司) ， Agilent 7697A顶空进样器 (美国安捷伦科技有限公司)， EL104 型电子分析天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司) .

试验共收集福建金线莲样本26个， 广西金线莲样本22个， 台湾金线莲样本18个. 样品用复合铝箔袋密封, 于25 ℃储存待用.

1.2 试验方法1.2.1 条件优化

不同顶空平衡条件影响目标物质的响应值大小， 响应值太小可能会导致无法检测到部分浓度太低但具有差异性的挥发性成分. 因此在进行数据采集之前， 需对顶空平衡时间和顶空平衡温度进行优化. 选取福建金线莲(漳州批次)主要挥发性成分中响应值高低不同的10种物质(质荷比分别为33.033 5、 42.033 8、 45.033 5、 59.049 1、 75.044 1、 87.080 4、 107.048 8、 111.153 7、 137.123 1、 164.251 2 )做为参照峰进行条件优化.

1.2.2数据采集

首先将顶空自动进样器与PTR-TOF-MS联用. 准确称取0.3 g金线莲样品 (未经过任何前处理)于10 mL顶空瓶中， 在80 ℃条件下恒温15 min以使顶空瓶内香气挥发物达到平衡. 接着利用PTR-TOF-MS对金线莲的香气指纹图谱进行收集. PTR-TOF-MS仪器条件如下： 漂移管电压640 V, 漂移管温度80 ℃， 漂移管压力 225 Pa, 相对电场强度(E/n) 140 Td, 漂移管中气体流量40 Pa·m3·s-1, 质荷比扫描范围为13～500. 每个样品以每秒一张全谱图的采集速率测量60 s. 每个样品独立进行3次试验, 取平均值， 得到样本平均值. 取一个空瓶, 在相同的条件下进行检测, 进行3次试验， 取平均值， 得空白平均值. 样本平均值减去空白平均值即得到进行统计分析的PTR-TOF-MS质谱数据.

1.2.3数据分析

利用SPSS22.0软件及Simca-p软件进行数学统计分析.

2 结果与分析

通过PTR-TOF-MS检测可以获取不同产地金线莲的挥发性成分指纹图谱， 通过对所得指纹图谱进行数学建模可以实现不同产地金线莲的分类识别. 各产地金线莲的PTR-TOF-MS指纹图谱如图1所示.

图1 不同产地金线莲的PTR-TOF-MS指纹图谱

2.1 条件优化2.1.1 顶空平衡温度的优化

固定顶空平衡时间为10 min， 顶空平衡温度分别为25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110 ℃， 观察各物质响应值的变化， 结果如图2所示. 通过固定平衡时间， 改变顶空平衡温度可以发现， 大部分挥发性物质的响应值在80 ℃后上升缓慢， 因此选择顶空平衡温度为90 ℃作为顶空平衡条件之一.

图2 不同产地金线莲主要挥发性成分响应值随平衡温度的变化Fig.2 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating temperatures

2.1.2顶空平衡时间的优化

固定顶空平衡温度为90 ℃， 顶空平衡时间分别为0、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 min， 观察各物质响应值的变化， 结果如图3所示. 通过固定平衡温度， 改变顶空平衡时间可以发现， 大部分挥发性物质的响应值在15 min后上升缓慢， 因此选择顶空平衡时间为15 min作为顶空平衡条件之一.

图3 不同产地金线莲主要挥发性成分响应值随平衡时间的变化Fig.3 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating times

2.2 快速准确识别方法的确立2.2.1 主成分降维

表1为主成分分析法中前10 个主成分的方差贡献率.

表1 主成分分析法中前10 个主成分的方差贡献率

对于大部分的判别分析方法来说， 太多的变量数目在建立模型时容易遭遇维数灾难. 在建立数学模型前先采用主成分分析(principal components analysis, PCA)进行降维处理. 以85%～95%为范围， 分别选取前2个主成分， 前3个主成分， 前4个主成分， 前5个主成分， 前6个主成分包含的质荷比数据作为降维后的数据建立各种数学分类模型.

2.2.2不同数学分类模型的识别结果

采用PCA降维后的数据分别与簇类独立软模式法(soft independent modeling of class analogy， SIMCA)[21]、K最近邻法(K-nearest neighbor， KNN)[22]、 偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA)[23]和费希尔判别分析(fisher discriminant analysis， FDA)[24]等4种判别识别方法结合， 寻找一种性能最优异的数学分类识别模型, 用来建立基于质子传递反应-飞行时间质谱的不同产地金线莲快速、 准确识别方法， 结果列于表2. 总样本数(n)均为45.

表2 不同产地金线莲的分类模型识别效果

由以上结果可以看出， 不同主成分数、 不同判别方法所建立的数学模型识别准确率各不相同. 其中， 当选取4个主成分数， 以FDA为判别方法时建立的数学分类识别模型准确率最高、 效果最佳， 总识别率达到97%. SIMCA法的准确率较低， 是因为其只是对各个主成分模型进行简单拟合， 容易受到各种因素的干扰. 与SIMCA法相比， KNN法对每一个待测样本进行分类预测都需要计算其与全体训练集样本之间的距离， 因此其误差会较小， 准确率较高. 但是对于金线莲这种产地之间差异变量多， 变量差异性小的样本集来说， 提取的主成分数量少时会造成信息缺失， 训练集和测试集的准确率都很低， 而提取的主成分数量多时， KNN法的泛化特性会导致训练集识别率随着更多有效信息的加入而提高， 但是测试集的识别效果却因为样本距离泛化大大降低. PLS-DA法与FDA法的准确率都要高于KNN法， 是因为PLS-DA法与FDA法作为线性模式的分类方法， 都对自变量进行重新投影来寻找一种更利于进行组间分类的线性组合从而进行判别， 因此其更能区分变量间的微小差异. 不同产地金线莲之间的变量之间较为独立， 即不是互相转化引起的成分差异性变化. 因此采用正交投影方法最大化方差来增大组间距离， 从而区分不同组别物质的FDA法的识别正确率, 会比依赖于对相互依赖变量之间进行回归分析到达分类目的的PLS-DA法更好一点.

3 结语

研究通过使用质子传递反应-飞行时间仪采集了不同产地金线莲VOCs指纹图谱， 并将其与几种数学分类识别模型相结合， 筛选最适合金线莲产地鉴别的分类模型. 实验结果表明， 当主成分数为4， 判别分析方法为FDA时， 识别效果最好. 分析可知， 对于具有各种微小差异成分的不同产地金线莲来说， FDA法建立的分类模型更为适用. 该方法具有快速、 准确、 无需样品前处理， 操作简单等优点， 为食品安全快速分析检测提供了一种新思路. 该方法同样可以推广应用到其他农产品的产地溯源中.