电针对去卵巢大鼠睡眠觉醒时程和睡眠觉醒累积量的影响

于心同，谢晨，刘臻，杨文佳，陈云飞*

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海市针灸经络研究所，上海 200030)

围绝经期是指妇女绝经前后的一段时期，可出现卵巢功能衰退的征兆，一直持续到最后一次月经后的1年，大致在45～55岁，是正常的生理变化时期。此时除月经的变化以及泌尿生殖系统的变化外，神经精神症状较为常见，其中失眠是最常见的临床症状之一。在我国，失眠作为围绝经期综合征中最常见症状，其发生率远超于西方国家围绝经期常见症状“潮热汗出”[1-2]。睡眠是人体的本能，人的一生有1/3的时间在睡眠中度过，失眠不仅能引起患者焦虑抑郁，还可进一步产生其他问题，因此围绝经期的睡眠健康需要引起足够重视。

针刺在世界范围已经被广泛用来治疗失眠，研究显示针刺可以改善患者的睡眠效率、日间功能、情绪障碍，提升睡眠质量，对患者的睡眠情况有显著的改善作用，同时，针刺治疗后每日觉醒次数、每日总睡眠时间、PSQI 评分、HAS 评分与西药组和假针刺组比较，差异均具有统计学意义[3]。课题组前期研究也表明针刺治疗围绝经期失眠具有良好的短期疗效，与假针刺组相比，可以明显降低失眠患者PSQI与ISI评分，显著提升睡眠效率和夜晚整体睡眠时间，并显著降低夜间觉醒时间，尤其可以减少患者浅睡眠时间[4]。

电针治疗围绝经期失眠的报道众多，疗效肯定，但是实验研究仍然缺乏对电针疗效的客观评价，为解决这一问题，本研究以去卵巢大鼠为模型，通过对模型大鼠进行电针和假电针干预，运用高度自动化的睡眠生物解析平台检测睡眠觉醒的变化情况，客观评价电针对去卵巢大鼠睡眠觉醒时程和睡眠觉醒累积量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雌性SD大鼠[许可证号：SYXK(沪)2018-0040]16只，6～8周龄，体质量(200±20)g。动物分笼饲养在睡眠-觉醒生物解析系统专用饲养笼中。饲养环境：恒温(24±1)℃、恒湿(60±2)%、隔音、静电屏蔽、7:00 am—7:00 pm(12 h/12 h)明亮黑暗周期(光照度≈100 lux)，动物可以自由活动、自由饮水、饮食，适应性饲养1周。经生殖道脱落细胞学观察，阴道脱落细胞出现典型的四天周期性变化用于本实验。采用随机数字表将动物随机均分为电针组和假电针组，每组10只。实验中对动物的处理符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂及仪器

水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；造牙粉(上海二医张江生物材料有限公司)；义齿基托树脂凝胶Ⅱ型(上海二医张江生物材料有限公司)；注射用青霉素钠(上海新先锋药业有限公司)；睡眠觉醒生物解析系统(Biotex Kyoto，日本)；脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；电钻(PROXXONGET，日本株式会社)；NeuroLog放大器(NL900D)；电针治疗仪(上海华谊医用仪器厂)；无菌针灸针(苏州华佗医疗器械有限公司)；电脑记录睡眠软件(sleepsign，Biotex日本)。

1.3 模型制备

按照参考文献[5]，大鼠在给予10%水合氯醛(360 mg/kg，腹腔注射)麻醉下行双侧卵巢切除术。大鼠背部手术区域剃毛，俯卧位固定,75%酒精消毒，在两侧髂嵴最高点连线与腰椎交点沿背部正中线向上做一纵行切口2～3 cm，分离皮肤筋膜与肌肉，脊柱旁开约1 cm，左右肋下钝性分离腰肌，提出卵巢组织并结扎，完整切除卵巢组织并观察包膜是否完整。常规缝合肌肉及皮肤，伤口处青霉素液1 mL(20 U/mL)点4～5滴，余液肌内注射。术后恢复3 d，所有大鼠每天行生殖道涂片观察生殖道脱落细胞，判定动情周期变化。模型大鼠生殖道涂片连续1周无成熟脱落细胞，证明手术成功，卵巢切除完整。

1.4 大鼠电极埋置术

10%水合氯醛(360 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，大鼠头颈部区域剃毛，固定于大鼠脑立体定位仪，参考相关文献[6]，在大鼠头部和颈部植入脑电图(electroencephalogram,EEG)和肌电图(electromyogram,EMG)电极，记录脑电波。将电极装好后，用造牙粉将记录电极封固于颅骨上，随后缝合皮肤创口，术后腹腔注射抗生素。将大鼠放入睡眠生物解析系统饲养笼内恢复，10 d后用于实验记录，同时按照12/12 h明暗周期饲养 (7:00 am—7:00 pm)，予以标准饮食和随时饮水。

1.5 电针治疗

电针组于造模后第10天，电针大鼠双侧“安眠穴”，取穴根据实验动物针灸穴位图谱(全国针灸学会实验针灸研究会制定)，隔天1次，共治疗7次。参数选用连续波，2 Hz。假电针的操作按照参考文献，将针灸针刺入皮下，同时不接电针[7-8]。

1.6 脑电图记录及分析

电针治疗前后记录大鼠脑电图(EEG)和肌电图(EMG)，大鼠脑电波和肌电波信号经睡眠生物解析系统放大、滤波、数模转换后，用SleepSign软件(Kissei Comtec,Nagano,Japan)记录，记录结束后，以4 s为分析单元，按统一设定的标准自动扫描判别出觉醒(Wake)、快速动眼(REM)睡眠、非快速动眼(NREM)睡眠，运用SleepSign分析软件自动扫描完成后，进行人工检查，必要时给予适当修正[9-10]。

1.7 评价睡眠觉醒

采用时程曲线及累积量直方图，以昼夜24 h为横坐标，以每小时各时相的量为纵坐标，绘制睡眠觉醒时程曲线(Time spend each stage)。根据统计结果，标记出组间有差异的点。时程曲线反映的是睡眠异常出现的时间。

计算昼夜12 h/12 h的累积量，做睡眠觉醒累积量直方图(Amount of each stage)，如数据点集中出现在某一时间区段，则计算这一时间区段的累积量，做出直方图。累积量直方图反应的是昼夜12 h/12 h或是某一时间段的睡眠变化。

1.8 统计学处理

实验数据由专门的统计分析人员审核后录入，采用SPSS 25.0软件进行统计分析。分析大鼠睡眠觉醒时程、睡眠觉醒累积量，采用配对t检验，组间数据比较采用方差分析。P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对去卵巢大鼠睡眠觉醒时程及睡眠觉醒累积量的影响

电针组治疗后，电针组大鼠Wake量减少，NREM睡眠量增多，在17:00点差异有统计学意义。REM睡眠无变化。见图1。

注：与治疗后比较，* P<0.05，**P<0.01。图1 电针组治疗前后睡眠觉醒时程的变化

经电针治疗后，电针组大鼠Wake量减少，全天Wake觉醒差异有统计学意义(P<0.05)。NREM睡眠量增多，在白天及全天与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.05)，REM睡眠无变化。见表1和图2。

注：与治疗后比较，* P<0.05。图2 电针组治疗前后睡眠觉醒累积量的变化

2.2 假电针对去卵巢大鼠睡眠觉醒时程及睡眠觉醒累积量的影响

假电针组治疗后，假电针组大鼠Wake、NREM、REM差异均无统计学差异。 见图3。

注：与治疗后比较，*P<0.05。图3 假电针组治疗前后睡眠觉醒时程的变化

假电针组治疗后，假电针组大鼠Wake、NREM、REM差异均无统计学差异。见表2和图4。

表2 假电针组治疗前后睡眠觉醒累积量的变化

3 讨论

中医学将围绝经期失眠归为“不寐”“经断前后诸症”等范围。女性围绝经期属于特殊的生理阶段，所以围绝经期失眠既有与内科病失眠有相似之处，又有其独特之处。

《素问·上古天真论》曰：“七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”女性一般在40～60岁的阶段处于围绝经期，古人所说的“年四十而阴气自半”正处于该生理阶段。

研究证实，电针调节围绝经期失眠的临床疗效显著，总有效率可达89.5%[11]。电针通过对下丘脑-垂体-卵巢(H-P-O)轴的良性调节，进而提高患者的雌激素分泌，重新建立雌激素的负反馈作用，进而调节围绝经期女性的内分泌系统。且电针还能提高围绝经期女性的免疫功能，调节其自由基代谢等[12]。

本研究选取安眠穴，位于翳风穴与风池穴连线的中点，穴下有皮肤、皮下组织、颈阔肌和头夹肌，有镇静安神之功。安眠穴为经外奇穴，临床验证其对治疗各种原因引起的失眠有奇特的疗效；实验研究证实，电针安眠穴能够增加大鼠的NREM睡眠，减少Wake；从现代医学角度，刺激头部穴位可改善局部微循环，解除脑血管痉挛，同时可刺激大脑皮层，抑制大脑异常放电，使人体达到真正放松状态而睡眠[13]。从解剖位置看，安眠穴位于胸锁乳突肌和头夹肌之中，针刺该穴能直接缓解肌肉痉挛，松解病变组织的粘连，改善局部血液循环，从而产生较好的疗效[14]。从实际操作看，电针安眠穴能够在大鼠自由活动的状态下进行，消除电针操作过程中因捆绑等造成的一些应激因素。

图4 假电针组治疗前后睡眠觉醒累积量的变化

脑电图是通过放置在头皮上的电极描记并加以分析的脑电波形[15]。1786年Galvani首次发现青蛙肌肉和外周神经的带点现象，开启了动物电学研究的大门；1875年Richard首次从兔脑上记录到自发脑电反应；1924年，Hans Berger第一次记录出人类头皮脑电图;1933年，诺贝尔奖获得者E.D.Adrian教授在肯定了Berger的发现后，脑电的研究得以迅速发展[16]。脑电图在针灸研究的应用中，主要作为针灸疗效的评价指标[17]以及作为针灸机制的分析方法[18]，同时在针刺镇痛[19]和针刺戒毒[20]中应用广泛。在对大鼠脑电进行分析时，Wake量越多说明觉醒量越多，NREM量越多说明睡眠量越多，而REM量在睡眠中占的比例较少，此阶段以梦境为主。

电针治疗围绝经期失眠疗效显著，但是缺乏客观科学评价，本实验采用高度自动化的睡眠解析平台评价了电针对去卵巢大鼠睡眠觉醒的调节作用，结果提示电针治疗后去卵巢大鼠NREM睡眠时间增加，觉醒时间减少，改善了去卵巢大鼠的失眠症状，假电针治疗后睡眠量无统计学意义。因此，电针“安眠穴”能增加去卵巢大鼠NREM睡眠时间，减少其觉醒时间，可以改善去卵巢大鼠的睡眠觉醒状态。