化肝解毒汤调控TLR4信号传导通路抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纤维化的实验研究

陈永祥，周舟

(1.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

慢性乙型肝炎是一种常见的以肝脏损伤为主的传染病，具有发病率高、病程持久、治愈难等特点[1]。我国约有1亿人感染过乙肝病毒，慢性乙型肝炎最初会出现肝脏纤维化，若肝脏纤维化得不到有效控制，会发展成肝硬化，甚至是肝癌[2]。由于目前临床尚无控制肝纤维化特效药物，因此寻找缓解乙肝患者肝纤维化的方法是控制慢性乙型肝炎进展的关键所在。化肝解毒汤主要成分有虎杖、平地木、半枝莲、土茯苓、垂盆草等，具有清热解毒、化瘀祛湿等功效。其中虎杖、半枝莲对肝纤维化有治疗效果[3-4]。此外，有研究表明，化肝解毒汤对慢性乙型肝炎有治疗效果，但作用机制尚未明晰[5]。TLR4在细胞天然免疫过程中发挥重要作用，但TLR4通路异常激活则会导致严重肝脏病变。有研究表明,TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活可引起下游TGF-β1通路活化，导致肝免疫异常，进一步导致肝纤维化恶化[6]。因此本研究基于TLR4通路研究化肝解毒汤对乙型肝炎大鼠肝纤维化的抑制作用，为化肝解毒汤的临床应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

4～5周龄SPF级SD雄鼠60只，体质量180～220 g,购自上海西普尔必凯实验动物有限公司[生产许可证:SCXK(沪)2018-0006]；四氯化碳(CCl4)购自上海金锦乐实业有限公司(纯度≥98%)。化肝解毒汤组方：虎杖15 g，平地木15 g，半枝莲15 g，土茯苓20 g，垂盆草20 g，赤芍10 g，姜黄10 g，黑料豆10 g，生甘草3 g，均购自同仁堂大药房;水飞蓟宾胶囊(天津天士力圣特制药有限公司)。

大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清中Toll样受体4(TLR4)、转录因子NF-κB(NF-κB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、层黏蛋白(LN) ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；大鼠血清透明质酸(HA)ELSIA试剂盒(上海卡迈舒生物科技有限公司)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒和Masson染色试剂盒(北京Solarbio科技有限公司)；TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1、β-actin单克隆一抗及二抗(美国R&D公司)；引物合成委托上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器

QuantStudio 3实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)仪(美国赛默飞公司)；ELx808酶标仪(美国Bio-Tek公司)；HHQ-1508切片机(杭州艾普仪器设备有限公司)；TGL20M高速冷冻离心机(上海赫田科学仪器有限公司)；DYCZ-24DN迷你蛋白垂直电泳仪(北京六一仪器厂)；CX33生物光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 药物制备

将虎杖15 g,平地木15 g,半枝莲15 g,土茯苓20 g,垂盆草20 g,赤芍10 g,姜黄10 g,黑料豆10 g和生甘草3 g加水煎至100 mL，浓度为1.18 g/mL，备用。

1.3.2 造模

随机挑出50只通过腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纤维化模型，按照1 mL/kg腹腔注射40% CCl4和橄榄油预混液，每周3次，连续建模8周。余下10只记为空白对照组，注射等体积生理盐水。检测ALP、ALT和AST活性,显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表示建模成功。将建模成功的大鼠随机分为5组：化肝解毒汤高、中、低剂量组，水飞蓟宾组和模型组。化肝解毒汤高、中、低剂量组分别灌胃9.2、4.6和2.3 g/kg化肝解毒汤；水飞蓟宾组灌胃50 mg/kg水飞蓟宾胶囊；空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。每日1次，连续治疗8周。

1.3.3 大鼠血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量检测

在治疗后通过ELISA法检测大鼠血清TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量。取大鼠尾静脉血,室温静置2 h后，4 ℃ 3 000 ×g离心20 min分离血清。按照ELISA说明书依次加入一抗、二抗、显色液、终止液。使用酶标仪在波长450 nm处测各样本光吸收值(OD)。

1.3.4 大鼠肝组织形态学观察

通过HE染色观察肝组织病理变化。取大鼠肝组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。石蜡包埋后切成厚度4 μm的组织切片。组织脱蜡后，按照HE染色试剂盒说明对切片进行HE染色。中性树脂封片后，在光镜下观察。

1.3.5 大鼠肝组织纤维化观察

通过Masson染色观察肝组织纤维化。同“1.3.4”项下所述制备肝组织切片，脱蜡复水后按照Masson染色试剂盒说明书对肝组织切片进行Masson染色，光镜下观察。

1.3.6 大鼠肝脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表达水平检测

通过RT-qPCR检测大鼠肝脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表达水平。取大鼠肝脏组织，研磨匀浆后使用Trizol提取细胞总RNA，并随即反转录为cDNA。按照Genbank上查询目的基因序列设计出TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA上下游引物。TLR4上游引物：5’-ATACAGGCATACAATGACCAT-3’，下游引物：5’-TATCGAATCGCGATACTAGATA-3’，产物长度105 bp；MyD88上游引物：5’-CTAGGATAGCTGAGATAAAC-3’，下游引物：5’-CTAAAGGCCAAGTTTAACAG-3’，产物长度122 bp；NF-κB上游引物：5’-ATCCGATGGATAAAGCTAGAT-3’，下游引物：5’-CCTAGAAGGTAGTTCGATAGA-3’，产物长度131 bp，TGF-β1上游引物：5’-TTACTGAACAGGTAGCCTAG-3’，下游引物：5’-GATCGAATCGGCATCGATAGC-3’，产物长度115 bp；持家基因β-actin上游引物：5’-GATTCTAGGCTACCAATACA-3’，下游引物：5’-TATCGACTTAGATCGAAGGA-3’，下游引物：5’-AGCTTAGACCATAGAG-3’，产物长度109 bp。退火温度55 ℃，40个循环。通过2-△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。

1.3.7 大鼠肝脏组织中TLR4、MyD88、总NF-κB、胞核NF-κB、胞质NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平检测

通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠肝脏组织中TLR4、MyD88、总NF-κB、胞核NF-κB、胞质NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平。取大鼠肝脏组织，研磨匀浆后加入组织/细胞裂解液提取总蛋白。取20 μL蛋白样品进行蛋白凝胶电泳，转膜后使用5% BSA室温封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜后更换二抗，室温孵育2 h，显色后使用扫描仪分析条带灰度值，以β-actin为内参，分析目的蛋白相对表达水平。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 CCl4致肝纤维化模型

建模过程中出现5只大鼠死亡，剩余建模大鼠血清ALP、ALT和AST活性显著高于空白对照组(P<0.05)，表明均建模成功。其中，空白对照组10只，其余各组均9只，治疗过程中，模型组出现1只大鼠死亡。见表1。

表1 各组大鼠血清ALP、ALT和AST活性比较

2.2 血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量比较

血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN水平模型组高于空白对照组(P<0.05)，水飞蓟宾组和化肝解毒汤高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与水飞蓟宾组比较，化肝解毒汤高剂量组指标改善更优(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量比较

2.3 肝组织形态学观察

空白对照组大鼠肝小叶结构正常，细胞排列整齐。模型组肝小叶结构已破坏，出现大量炎性细胞浸润并且肝细胞出现严重水肿和脂肪变性。水飞蓟宾组和化肝解毒汤高、中、低剂量组与模型组相比均出现好转，其中水飞蓟宾剂量组与空白对照组最接近。见图1。

图1 各组大鼠肝组织形态学观察(HE，×200)

2.4 肝组织纤维化情况比较

空白对照组肝组织汇管区未出现扩大和纤维结缔组织增生，肝细胞结构正常,排列整齐。模型组肝组织出现大量胶原纤维增生，汇管区扩大变形，肝小叶被假小叶替代，肝细胞界限不清排列紊乱。水飞蓟兵组和化肝解毒汤高、中、低剂量组均出现好转，其中化肝解毒汤高剂量组好转最明显，与空白组接近。见图2。

2.5 肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表达量检测

大鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表达结果显示，模型组均高于空白对照组(P<0.05)，水飞蓟宾组和化肝解毒汤高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与水飞蓟宾组比较，化肝解毒汤高剂量组指标改善更优(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表达量比较

2.6 肝组织TLR4、MyD88、总NF-κB、胞核NF-κB、胞质NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平检测

大鼠肝组织TLR4、MyD88、总NF-κB、胞核NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平模型组高于空白对照组(P<0.05)，水飞蓟宾组和化肝解毒汤高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与水飞蓟宾组比较，化肝解毒汤高剂量组降低(P<0.05)，低剂量组升高(P<0.05)；大鼠肝组织胞质NF-κB蛋白表达水平模型组低于空白对照组(P<0.05)，水飞蓟宾组和化肝解毒汤高、中、低剂量组均高于模型组(P<0.05)，与水飞蓟宾组比较，化肝解毒汤高剂量组指标改善更优(P<0.05)。见图3、图4和表4。

图3 大鼠肝组织TLR4、MyD88、总NF-κB、胞质NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平检测(Western Blot)

表4 各组大鼠肝组织TLR4、MyD88、总NF-κB、胞核NF-κB、胞质NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平比较

图4 大鼠肝组织胞核NF-κB蛋白表达水平检测(Western Blot)

3 讨论

乙型肝炎发病呈现全球性分布，严重威胁人类健康。慢性乙型肝炎是乙肝病毒感染引起的免疫功能紊乱,能进一步导致肝损伤的慢性疾病[7]。中医学认为，慢性乙型肝炎属“胁痛”“黄疸”范畴,是由于肾精不足伤及肝阴，引起肝肾气虚，湿热邪毒侵入肝经所致，该病治疗需要解毒祛湿、疏肝活血、治肝补脾[8]。化肝解毒汤由虎杖、平地木、半枝莲、土茯苓、垂盆草、赤芍、姜黄、黑料豆和生甘草组成。其中，虎杖、平地木和半枝莲可清热解毒、活血化瘀、祛湿利水；土茯苓和垂盆草可增强清热解毒、祛湿的功效；赤芍和姜黄可活血祛瘀、行气止痛；黑料豆和生甘草可平肝养血、培补脾肾、益气补中；诸药联用共奏清热解毒、祛湿利水、活血行气之效[9]。有研究表明，化肝解毒汤可调节慢性乙型肝炎大鼠免疫紊乱，减轻肝损伤[10]。因此本研究探索化肝解毒汤对慢性乙型肝炎大鼠肝纤维化的抑制作用并探讨其作用机制。水飞蓟宾是植物乳蓟提取物，可预防肝纤维化、肝硬化等，常运用在慢性乙型肝炎的临床治疗中[11],因此本研究选择水飞蓟宾胶囊作为阳性对照药物。

TGF-β1是肝纤维化重要的细胞因子，可促进细胞外基质合成并可促进成纤维细胞增殖[12]。有研究表明，慢性乙肝患者血清中TGF-β1水平显著升高[13]。HA是肝结缔组织基质的主要成分，通常在肝组织内皮细胞中降解[14]。但是在肝纤维化过程中，肝星状细胞合成HA能力增强，却因内皮细胞病变而降解,能力减退，最终导致HA在血液中水平异常增高[15]。LN是基底膜的成分之一，由肝内皮细胞合成。有研究表明，肝纤维化患者血清HA和LN均表现出异常升高[16]。因此，TGF-β1水平的提高可促进HA和LN水平，促进肝纤维化发生[17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清TGF-β1、HA和LN水平均显著升高，而经过化肝解毒汤治疗后,血清TGF-β1、HA和LN水平均降低，由此表明，化肝解毒汤可缓解肝纤维化。HE染色结果显示,模型组肝小叶结构被破坏，出现大量炎性细胞浸润，肝细胞出现严重水肿和脂肪变性。而经过化肝解毒汤治疗后，炎性细胞浸润明显减少，肝织病变明显减轻。表明化肝解毒汤对大鼠肝损伤具有治疗效果。Masson染色结果发现，模型组大鼠肝组织出现大量胶原纤维增生，而经过化肝解毒汤治疗后纤维增生显著减少，由此表明，化肝解毒汤可抑制大鼠肝纤维化。

TLR4通路在细胞凋亡、信号传导、炎性反应等过程中发挥重要作用[18]。TLR4可与MyD88结合形成复合物，并激活NF-κB，使其发生核位移，NF-κB的激活是调控多种炎性因子的关键[19]。NF-κB进入细胞核促进炎性因子表达导致炎性因子大量释放最终使TGF-β1信号通路活化，导致肝脏纤维化[20]。有研究表明，TLR4-MyD88-NF-κB参与肝异常炎性反应，肝星状细胞活化和肝纤维化过程[6]。此外有文献指出，抑制TLR4信号通路可对抗肝纤维化[21]。本研究结果表明，模型组大鼠肝组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平异常升高，胞质NF-κB蛋白水平降低而胞核NF-κB蛋白水平升高，提示TLR4-MyD88-NF-κB通路激活。而经过化肝解毒汤治疗后，TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均降低，且胞核NF-κB蛋白水平降低，而胞质NF-κB蛋白水平升高，提示TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制，TGF-β1信号通路抑制。由此可推测，化肝解毒汤可抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纤维化，机制可能与抑制TLR4通路和TGF-β1通路激活有关。

综上所述，化肝解毒汤可抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纤维化，降低肝组织损伤，推测机制可能与抑制TLR4通路，下调TLR4、MyD88、NF-κB、mRNA和蛋白表达水，抑制NF-κB核位移，引起下游TGF-β1表达抑制，降低血清HA和LN水平有关。导致慢性乙型肝炎肝纤维化信号通路较为复杂，化肝解毒汤对其他通路是否有影响尚未可知，有待进一步研究。