水肥胁迫对不同尾叶桉无性系叶绿素荧光特性的影响

杨会肖，廖焕琴，杨晓慧，徐 放，张卫华，潘 文

（广东省林业科学研究院/广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520）

【 研究意义】 尾叶桉属双蒴盖亚属（Symphyomyrtus subgenus）横脉组（TransversariaSection），天然分布于印度尼西亚弗洛勒斯、爱罗瑞岛、朗伯莱岛、潘塔岛、艾道尼瑞岛、韦塔岛及东帝坟的帝汉岛。目前，桉树产业包括种苗、肥料、制材、制浆造纸、人造板、生物质能源和林副产品等产业链，年总产值在3 000 亿元以上。桉树产业不仅在保障我国木材安全问题上发挥了巨大作用，也在天然林资源保护、林农脱贫致富、乡村振兴等方面做出了重要贡献。【前人研究进展】自20 世纪80 年代在华南地区开展种源试验以来，尾叶桉逐渐成为华南地区的主要栽培树种。目前尾叶桉及其杂种无性系人工林面积已达95 万hm2，占我国华南地区桉树人工林面积60%，是该地区重要的纸浆材造林树种之一。植物正常生长的环境因子主要包括水分和养分，在水分和养分受到限制的条件下，合理的水肥配置才能显著地提高植物生产力［1-2］。国内外对桉树研究主要集中在引种、育种［3-4］、栽培［5-6］和木材特性［7］等方面，而对桉树在不同水肥条件下光合生理特性的研究甚少。叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速、无损伤的探针［8］，多应用于光合作用机理、植物抗逆生理、农林物增产潜力预测等方面［9］，但有关水肥胁迫处理下叶绿素荧光特性对尾叶桉无性系的综合质量评价的研究还未见报道。

【本研究切入点】本试验采用人工控制水分和养分的方法，研究水肥胁迫对19 个尾叶桉无性系生长、叶形和叶绿素荧光参数的影响，通过系统评价不同水分和养分条件下尾叶桉生长、叶形和叶绿素荧光参数的差异，以及相关性、主成分和聚类分析，以期为高光效亲本的选择和高效优质栽培提供理论依据。【拟解决的关键问题】针对我国南方桉树人工林无性系单一、品种衰退明显、病虫害发生日趋严重，急需选育优良品种对现有栽培品种进行替换的需求，结合生长、叶形和叶绿素荧光特性综合性状评价，筛选适合不同水肥条件下生长的尾叶桉无性系，或利用传统育种与现代育种相结合的手段进一步改良尾叶桉亲本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016 年4—10 月在广东省林业科学研究院后山苗圃内（113°23'，E23°14'N）进行。该区属于典型亚热带季风气候，年降水量1 638 mm，年平均温度23 ℃，海拔25 m，最低1 月平均气温13.3 ℃，最高8 月平均气温38.1 ℃，年平均湿度为79%。供试尾叶桉无性系19 个，其来源见表1。

表1 19个尾叶桉无性系基本信息Table 1 Basic information of 19 clones of Eucalypyus urophylla

1.2 试验方法

试验采用2 因素（水分、养分）3 水平完全随机区组设计，选取生长一致的19 个尾叶桉（Eucalyptus urophylla）无性系幼苗（平均苗高为70 cm）移栽到圆形控根器容器中。试验设9个水分养分处理，分别为处理11（低水分低养分）、处理12（低水分正常养分）、处理13（低水分高养分）、处理21（正常水分低养分）、处理22（正常水分正常养分）、处理23（正常水分高养分）、处理31（高水分低养分）、处理32（高水分正常养分）、处理33（高水分高养分）。具体水分梯度参照杨会肖等方法［10］。养分处理分为基肥和追肥两种处理，其中以钙镁磷和复合肥为基肥肥料，追肥以尿素和复合肥为肥料。水肥处理自缓苗期1 月后进行控制。

低养分处理基肥施钙镁磷肥250 g/盆；正常养分处理基肥施钙镁磷肥250 g/盆，追肥1 次，施复合肥150 g/盆；高养分处理基肥施钙镁磷肥250 g/盆和复合肥150 g/盆，追肥2 次，分别施尿素100 g/盆和复合肥150 g/盆。

1.3 叶绿素荧光参数测定

于2016 年10 月中旬对尾叶桉生长、叶片形态和叶绿素荧光参数进行测定，其中生长和叶片形态具体测定及分析参照杨会肖等［10］方法。叶绿素荧光参数测定选择在晴朗天气上午9:00～11:00和下午14:00～16:00，采用LI-COR 公司生产的LI-6800 型便携式光合测定仪，每个植株选取3～5 片完全展开的功能叶片，测量前将样品用锡纸包裹，暗适应处理20 min 后测定各项荧光指标，每个叶片重复测定3 次。首先测定暗适应叶绿素荧光参数包括初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、最大PS Ⅱ光能转化效率（Fv/Fm））；再打开活化光（1 500 μmol/m2· s）活化20 min，测定光适应下的参数，包括净光合速率（Pn）、初始荧光（Fo′）、光适应下最大荧光（Fm′）、光适应下稳态荧光（FS）、光适应下最大可变荧光（Fv′），计算光化学淬灭系数（qP）、非光化学猝灭系数（NPQ）、表观量子传递速率（ETR）及实际光化学效率（ΦPSⅡ）等参数。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2020进行整理，采用R 软件进行分析，不同水肥及无性系间平均值的比较采用最小显著差数法（LSD）进行多重比较，生长、叶片形态和叶绿素荧光参数间采用Pearson 相关分析法，无性系间的聚类分析采用最短距离和欧式距离聚类法。

2 结果与分析

2.1 水肥胁迫对尾叶桉生长性状的影响

由图1可知，在不同水肥条件下，尾叶桉树高、地径和冠幅之间发生明显变化，树高由小到大依次为处理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜13 ＜22 ＜23＜33，9 个处理间差异均达显著水平，其中处理33 的树高比处理11 高134%；地径由小到大依次为处理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜22 ＜13 ＜23＜33，除处理11 和22 的差异不显著外，其他处理间差异均达显著水平，其中处理33 的地径比处理11 和22 高136%；冠幅由小到大依次为处理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜22 ＜13 ＜33 ＜23，9 个处理间差异均达显著水平，其中处理23 的冠幅比处理11 高100%。

图1 水分和养分互作对尾叶桉生长量的影响Fig.1 Interactive effects of water and nutrient on growth yield of Eucalyptus urophylla

2.2 水肥胁迫对尾叶桉叶绿素荧光参数的影响

植物对光能的利用可通过叶绿素荧光参数的变化来反映。由表2 可知，在低水分处理下，施入低量的养分时，不同尾叶桉无性系间的初始荧光（Fo）、PSII 实际光化学效率（ΦPSⅡ）、光化学荧光猝灭系数（qP）和电子传递量子产量（ETR）差异均达到显著水平，其他叶绿素荧光参数间差异不显著，其中2、3、5、6、8、9、13、15、16、14 和18 号无性系的4 个叶绿素荧光参数均无显著差异，无性系1 的4 个叶绿素荧光参数比无性系10 分别高2.5%、155.6%、111.5% 和161.8%；施入正常量的养分时，不同无性系的最大荧光（Fm）、qP和NPQ差异均达显著水平，而其他叶绿素荧光参数差异未达显著水平，其中无性系16 的Fm比无性系9 高45.1%，无性系1的NPQ比无性系4 高109.5%，无性系4 的qP比无性系16 高171.4%。在低水分处理下，施入高量的养分时，不同无性系的Fo、Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR差异均达到显著水平，其中无性系17 的ΦPSⅡ、qP和ETR分别比无性系10 高288.9%、187.5% 和278.1%，无 性 系4 的Fo比无性系15 高23.2%，无性系12 的Fm 比无性系14 高21.6%，无性系13 的NPQ比无性系15 高101.7%。

表2 19个尾叶桉无性系在低水分条件下的叶绿素荧光参数Table 2 Chlorophyll fluorescence parameters of 19 clones of Eucalyptus urophylla under low water stress

由表3 可知，在正常水分处理下，不同尾叶桉无性系高养分处理的所有叶绿素荧光参数差异均未达到显著水平。当施入低量的养分时，Pn以无性系4 最大、无性系3 最小，Fo 以无性系2 最大、无性系10 最小，其他无性系间差异未达显著水平；ΦPSⅡ、qP和ETR分别以无性系11、4 和11 最大，均以无性系3 最小。当施入正常量的养分时，NPQ以无性系7、11 和14 最大，无性系4最小。

由表4 可知，在高水分处理下，施入低量的养分时，不同尾叶桉无性系的Fo、Fm和Fv/Fm差异均达显著水平，其中Fo以无性系4、5 最大，无性系14 最小；Fm以无性系5 和10 最大，无性系14 最小；Fv/Fm以无性系2、3、5、10、12 和13 最大，无性系9 最小。在高水分处理下，施入正常的养分时，不同尾叶桉无性系的ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR差异均达显著水平，其中无性系13 的ΦPSⅡ、qP和ETR比 无 性 系12 分 别 高633.3%、316.7%和625.4%，NPQ则比无性系12低192.2%。在高水分处理下，施入高量的养分时，Pn以无性系10 最大，无性系8 最小；Fo以无性系8 最大，无性系16 最小；ΦPSⅡ、qP和ETR以无性系18 最大，无性系8 最小，无性系18 的ΦPSⅡ、qP和ETR分 别 比 无 性 系8 高320.0%、206.7%和329.2%。

表4 19个尾叶桉无性系在高水分条件下的叶绿素荧光参数Table 4 Chlorophyll fluorescence parameters of 19 clones of Eucalyptus urophylla under high water stress

2.3 尾叶桉生长、叶形与叶绿素荧光参数的相关性和主成分分析

由表5 可知，除平均鲜重、平均干重和平均厚度外，尾叶桉无性系生长与叶形的相关性呈极显著正相关，相关系数为0.23～0.46,；生长与荧光参数（Pn、Fm'和Fs）均呈极显著相关，其中与Pn呈负相关，相关系数为0.19～0.21，与Fm'和Fs呈正相关，相关系数为0.16～0.21；荧光参数（Pn、Fm'和Fs）与叶形大部分性状呈显著负相关，相关系数为0.14～0.23；NPQ仅与ETR极显著相关，Pn与ΦPSⅡ、qP、qN呈显著或极显著相关，Fo、Fm、Fm'、Fs、ΦPSⅡ、qP与qN均呈显著或极显著负相关，相关值介于-0.24～0.96。由此可见，尾叶桉同种类型（生长性状间、叶形间和荧光参数）性状间的相关系数较大，而不同类型性状间（生长与叶形、生长与荧光参数、叶形与荧光参数）的相关性达到了显著水平，但相关值较小。

由于不同类型性状间的相关系数较低，因此对尾叶桉生长、叶形与叶绿素荧光参数26 个性状进行主成分分析，结果（表6）显示，在第1主成分中叶面积、叶片长、叶周长、平均鲜重、平均干重、叶片宽和平均叶柄长占有较高系数，方差贡献率为39%，说明第1 主成分是表示叶子大小和重量的综合因子；在第2 主成分中Fm'、Fs和地径占有较高系数，方差贡献率为32%，说明第2 主成分是表示叶绿素荧光和生长的综合因子；在第3 主成分中平均厚度、地径、树高和冠幅占有较高系数（呈异号），方差贡献率为13%，说明第3 主成分是表示生长和叶片厚度的综合因子；在第4 主成分Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm和Fo占有较高系数，方差贡献率为9%，说明第4 主成分是表示光合速率和叶绿素荧光参数的综合因子。前4 个主成分的累积方差贡献率为93%，包含了26 个指标的大部分信息，因此选取前4 个主成分作为尾叶桉生长、叶形和叶绿素荧光参数性状选择的综合指标。由此可知，尾叶桉生长、叶形和叶绿素荧光参数性状之间的差异主要表现为叶面积、叶片长、叶周长、平均鲜重、平均干重、叶片宽、平均叶柄长、平均厚度、地径、树高、冠幅、Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm、Fm'、Fs和Fo的不同。

表6 尾叶桉无性系生长、叶形与叶绿素荧光参数的主成分分析Table 6 Principal component analysis of seedling growth,leave shape and chlorophyll fluorescence parameters of Eucalyptus urophylla clone

2.4 聚类分析

以尾叶桉在不同水肥胁迫条件下的生长量（地径、树高和冠幅）、叶片性状（叶面积、叶片长、叶周长、平均鲜重、平均干重、叶片宽、平均叶柄长和平均厚度）和叶绿素荧光参数（Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm、Fm'、Fs和Fo）为参数，采用最短距离和欧式距离聚类法对19 个尾叶桉无性系进行聚类分析，结果（图2）显示，18 个生长、叶形和叶绿素荧光参数性状能将19 个尾叶桉无性系完全区分，说明这些性状能反映各样品间的差异。取阈值为10 时，19 个尾叶桉无性系可分为4 组，第1 组包含3 份材料，约占总样本数的15.8%；第2 组可分为2 个亚组，包含8 份材料，约占总样本数的42.1%；第3 组包含3 份材料，约占总样本数的15.8%；第4 组包含5 份材料，约占总样本数的26.3%。由此可见，19 个尾叶桉无性系具有各自的生长、叶形和叶绿素荧光参数表型特征，可为尾叶桉种内和种间杂交育种亲本的选择提供参考。

图2 基于生长、叶形和叶绿素荧光参数19 个尾叶桉无性系聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 19 clones of Eucalyptus urophylla based on growth,leave shape and chlorophyll fluorescence parameters

3 讨论

N 是植物体内分布最广的营养元素之一，是植物生长的必需养分，同时也是合成叶绿素的组分元素，当植物缺N 时，体内叶绿素含量下降，叶色发黄，光合作用强的羧化效率度减弱，光合产物减少，从而使作物产量降低［11］。随着N 元素的增加，植物可溶性蛋白含量及Rubisco 含量增加，从而增加植物的光合速率。P 对植物体内许多重要化合物的组成及多种营养代谢有重要作用，因此P 元素的提高对植物光合速率有重要意义。K 呈离子状态溶于植物汁液中，在植物中主要起催化作用，能够促进光合作用，缺K 使光合作用减弱。水分胁迫不仅影响植物光合作用中的光合电子的传递、光合磷酸化等过程，也直接引发光合机构的损伤［12］，因此，水肥控制能够在一定程度上改善植物生存环境，增加植物光合速率，提高产量。

植物体内叶绿素荧光作为快速探针在鉴定、评价植物抗逆性方面的应用越来越多。叶绿素吸收的光能主要通过光合电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散3 种途径消耗［13］，3 种途径存在此消彼长的关系。因此，可利用叶绿素荧光参数研究水肥胁迫下植物光合作用和热耗散的情况。本研究中，19 个尾叶桉无性系在水肥胁迫下叶绿素荧光参数Fo、Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ、ETR和Fv/Fm均差异显著，但不同水肥处理条件下，达到显著差异的荧光参数有很大不同。Fo增加或减少不仅反映PS Ⅱ反应中心不易逆转的破坏或天线色素的热耗散增加，而且Fo与叶片叶绿素浓度有关［14］。在不同水分条件下，Fo在低养分处理下都达到了显著差异，这可能与低养分的植株叶片偏红而叶绿素浓度较低有关，具体原因需进一步分析。Fv/Fm 是近年来常用的研究植物对逆境响应的重要生理参数，是植物发生光抑制最明显的特征［8,15］。在19 个尾叶桉无性系中，无性系2、8、9、12 和17 在水肥处理21 和32 下的值低于0.75，说明这些无性系PS Ⅱ的最大光化学效率受水肥胁迫的影响较大。不同水肥胁迫处理下无性系5 和10 的Fv/Fm值高于其他无性系，说明其PS Ⅱ反应中心的光能捕获效率高，能更有效地将光能转化为其生长所需的化学能［16-17］。

相关性分析表明，尾叶桉无性系在不同水肥胁迫处理6 个月后苗木的树高、地径和冠幅与Fm、Fv/Fm、ΦPSⅡ和ETR呈显著或极显著正相关，说明尾叶桉无性系的叶绿素荧光参数与其生长表现密切相关，光合活性越强，生长表现则越好，这与张培等［18］和张杰等［19］的研究结果相似。非光化学淬灭NPQ用来评价植物耗散过剩激发能的能力，尾叶桉无性系的树高、地径和冠幅与NPQ呈负相关，但相关系数未达到显著水平；叶周长和叶面积与Fo达到显著负相关，而Fo是代表色素所吸收的全部光能中不参与光化学反应的一部分能量，Fo升高说明色素吸收的光能参与光化学反应的能量减少，以热量和荧光形式散失的部分增加。吕芳德等［20］发现不同无性系红山茶Fo与叶绿素含量有关，但植物叶尖角、叶片长、叶片长/宽、叶周长和叶面积与叶绿素荧光参数之间的相关研究未见报道。杨会肖等［10］以生长和叶片形状为依据，从20 个尾叶桉无性系中选择了4 个优良无性系，其树高、地径和冠幅比对照分别高5.0%、12.8%和14.5%。本研究与上述参试的无性系相同，从光合生理角度出发，无性系5（LDUA10）和10（LDUA24）具有较强的光化学特性。由此可见，不同水肥胁迫下的尾叶桉无性系的选择可结合生长量、叶形和叶绿素荧光特性，使优良无性系选择更加可靠。

4 结论

桉树是华南地区最重要的产业化树种。本研究结果表明，19个尾叶桉无性系在不同水肥处理下的叶绿素荧光参数差异显著，以高水高肥处理对不同无性系ΦPSⅡ、ETR的影响更加显著。尾叶桉同种类型性状间的相关系数较大（最高0.99），而不同类型间的相关性虽达到显著水平但相关值较小（最高仅为0.21）。主成分分析表明，前4个主成分的累积方差贡献率为93%，19个尾叶桉无性系具有各自的生长、叶形和叶绿素荧光参数表型特征，其中无性系5（LDUA10）和10（LDUA24）生长表现好且具有较强的光化学特性，可作为优良无性系在生产上推广应用。