高效液相色谱法测定连花清瘟胶囊的连翘苷含量

方慧琼，吴应帅，肖芳红

赣州市食品药品检验检测中心，江西 赣州 341000

连花清瘟胶囊是由连翘、炙麻黄、金银花、炒苦杏仁、石膏、绵马贯众、板蓝根、大黄、鱼腥草、广藿香等13 味中药组成，具有宣肺泄热，清瘟解毒的功能［1］。临床上常用于治疗流行性感冒、热毒袭肺证［2］。治疗轻型、普通型新型冠状病毒肺炎患者疗效颇佳,其在控制病情进展、改善临床症状、抑制机体炎症反应方面有一定优势,可用于新型冠状病毒肺炎早期防治［3-4］。目前有少量标准对连翘苷的含量测定采用薄层扫描法，本文采用高效液相法测定连翘苷的含量，不仅能减少含量测定中的误差，且能提高准确度［5-6］。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置VWD 检测器、四元泵、自动进样器、柱温箱、Openlab 工作站（安捷伦公司）；XSE205DU 型电子天平（梅特勒天平公司）；KQ-600KDB 高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PURELAB Chorus 1 型超纯水机（ELGA LabWate）。

连翘苷对照品（批号：110821-201816，含量：95.1%），购自中国食品药品检定研究院，供HPLC含量测定使用；连花清瘟胶囊［批号：A1911071，A1911068，A1801264，B2001081，石家庄以岭药业股份有限公司生产（市售）］。

甲醇（上海振兴化工一厂，批号：202003201），水为超纯水（自制），乙腈（色谱纯，SIGMAALDRICH 公司），磷酸（西陇科学股份有限公司，批号：171115）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch ultimate AQ C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）为流动相；流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm；理论板数按连翘苷计不得低于3 500。

2.2 对照品溶液制备

精密称取连翘苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL 含4 μg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物，研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 w，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL，置25 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

精密度考察：取样品（批号：A1911071），按“2.3”的制备方法制备供试品溶液，进样测定6 次。结果峰面积的RSD 为0.49%（n=6），表明仪器精密度良好。

线性关系考察：精密称取连翘苷对照品0.010 95 g，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，作为贮备液。量取贮备液各1，2，2，10，10 mL，分 别 置100，100，50，100，50 mL 量 瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，分别制成含连翘苷为1.041，2.083，4.165，10.41，20.83 μg/mL 系列对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积分别为88，16，354，878，1 760，以进样中连翘苷的量（µg）为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，得回归方程Y＝84.449X+0.452 6（r=0.999 9）。结果表明，连翘苷进样量在1.041～20.82 μg 范围内呈良好线性关系。

重复性试验：取样品（批号：A1911071），按“2.3”制备方法制备6 份，分别测定。结果RSD 为0.66%（n=6），表明重复性良好。

稳定性试验:取重复性项下供试品溶液于0，2，5，12，24 h 时分别进样10 μL，测定连翘苷的峰面积。面积的RSD 为0.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取线性关系中的对照贮备液，备用。取已知含量的样品（批号A1911071，连翘苷含量为2.16 mg/g）约0.25 g，精密加入连翘苷对照贮备液5 mL，甲醇15 mL，按供试品溶液的处理方法处理制备成加样回收供试品溶液，按含量测定方法测定含量。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.5 样品含量测定

取连花清瘟胶囊内容物0.5 g，精密称定，按“2.3”制备溶液并进样，测定峰面积，计算连翘苷的含量。样品中连翘苷的含量见表2。供试品和对照品的色谱图见图1。

表2 连翘苷含量测定结果（mg/g，n=4）

图1 液相色谱图：A.对照组，B.供试品。

3 讨论

在本实验中，曾选用乙腈-水，甲醇-磷酸体系作为流动相，乙腈-水分离效果不及乙腈-磷酸体系好；甲醇-磷酸分离效果和乙腈-磷酸效果相差不大，故使用乙腈-磷酸体系为流动相。对Waters，月旭，炫美3 个品牌的色谱柱进行了考察，分离效果都很好，所以此方法对色谱柱无特殊要求。2020 年版《中国药典》采用HPLC 法测定连翘苷含量，供试品溶液的制备须经过提取、蒸干、过柱、洗脱、浓缩至干等步骤。经过中性氧化铝柱层析净化脂质以避免其对连翘苷色谱峰的干扰，但中性氧化铝在去除杂质的同时，指标成分连翘苷也因为被吸附或操作步骤繁琐而被损失，容易使得测得结果偏低，故在连花清瘟胶囊含量测定中,参考某些文献，省去过柱步骤，减少了操作过程中的损失，结果说明该方法快速简便、精密度高、稳定性、重复性好，可用于连花清瘟胶囊中连翘苷的含量测定，为此类产品的质量控制作参考［7-15］。