肾脾双补口服液中淫羊藿苷含量测定方法的改进

康志华，廖玉群，杨雷，熊家伟

江西药都仁和制药有限公司，江西 樟树 331200

肾脾双补口服液为独家生产品种，处方由熟地黄、山药、五味子（醋蒸）、枸杞子、菟丝子、山茱萸（制）、泽泻、淫羊藿、陈皮、鸡内金（砂炒）、山楂（炒）、车前子共十二味组成。共奏补肾健脾之功效,用于脾肾两虚之体倦食少，头晕耳鸣，腰膝酸软等症。其注册标准WS-5494-（B-0494）-2014Z 中已收载有山茱萸、淫羊藿苷、橙皮苷、熟地黄、枸杞子的薄层鉴别及淫羊藿苷的含量测定。生产实践中发现，淫羊藿苷的含量测定方法烦琐，重现性不是很理想，分析检测周期较长。故经过大量实验摸索，对原方法进行了改进，改进后的方法操作简便，重复性良好，结果准确，具有专属性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：岛津LC-20AD（日本岛津公司）；安捷仑1260 Ⅱ（美国按捷仑公司）；色谱柱：安捷仑C18、月旭C18、依利特 C18，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm；赛多利斯公司电子天平：CP224S（d=0.1 mg），CP225D（d=0.01 mg、0.1 mg）。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110737-201516）；肾脾双补口服液样品（江西药都仁和制药有限责任公司）；乙腈为色谱纯（美国天地公司）；水为超纯水；磷酸、乙醚、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原注册标准方法

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（30∶70）为流动相；检测波长为270 nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000。

对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL 含40 µg 的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品10 mL，加于已处理好的聚酰胺柱（柱内径约1 cm，聚酰胺粉50～80 目，5 g，干法上柱）上，放置2 h，用水50 mL 冲洗，弃去水洗液，再用乙醇50 mL 洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，残渣用50%甲醇使溶解，定量转移至10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 µL，注入液相色谱仪，测定，即得。

在大量的生产实践中发现，本法重现性不理想，影响因素较多，不能真实反映出淫羊藿苷的含量。

2.2 改进后的方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）为流动相［1-7］；检测波长为270 nm；流速1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35 ℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000。

供试品溶液的制备：精密取本品10 mL，加水10 mL 稀释，用乙醚振摇提取2 次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取4 次［5-8］，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用稀乙醇溶解并转移至10 mL 容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液的制备：按处方取不含淫羊藿的其它药材，依制法制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 µL，注入液相色谱仪，测定，即得。

分析方法确认：按照《中国药典》2015 年版四部通则9101 药品质量标准分析方法验证指导原则，选取专属性、检测限、定量限、回收率、精密度、耐用性、稳定性为确认指标，对改进后的分析方法进行了确认，结果淫羊藿苷能够较好地分离，保留时间适中，阴性无干扰，专属性好，色图谱见图1。

2.3 原注册标准方法及改进后的方法对比

取供试品（批号201001），分别采用原注册标准方法及改进后的方法，进行精密度、加样回收率、耐用性试验，测定淫羊藿苷的含量，检测结果见表1，2。

表2 加样回收率试验结果对比（%）

结果，原注册标准方法精密度、加样回收试验及耐用性试验的RSD 分别为8.5%、6.3%和7.3%，改进后方法的精密度、加样回收试验及耐用性试验的RSD 分别为0.57%、0.31%和0.69%，表明原方法的精密度、准确度及重现性不理想，RSD 均超过2%，而改进后方法的精密度、准确度及重现性良好，能真实地反应出本品中淫羊藿苷的含量，可用于本品的质量控制［9-17］。

3 样品测定

取本品10 批，分别按原方法及改进后的方法测定淫羊藿苷的含量，改进后的方法检测的淫羊藿苷的含量均比原方法检测结果高。结果见表3。

表3 10批样品中淫羊藿苷的含量

4 讨论

4.1 供试品溶液的制备

原标准将样品通过聚酰胺柱进行柱层析，去除部分杂质的同时对淫羊藿苷也会有一定的吸附，且层析柱的装填紧实度、洗脱的速度等，对结果均有影响，造成方法重现性不理想，回收率偏低［7］；故对方法进行改进研究，试验中曾采用大孔树脂柱进行柱层析［8］,结果回收率偏低;以先采用乙醚振摇提取，除去脂溶性成分，再用乙酸乙酯振摇提取4 次的方法为佳，淫羊藿苷提取完全，方法简便，重现性好，回收率理想。故按改进后的方法检测的淫羊藿苷的含量均比原方法检测结果高。

4.2 流动相的选择

原标准中采用乙腈-水（30∶70）为流动相，结果淫羊藿苷峰拖尾严重；分别对比了冰醋酸溶液与磷酸溶液的对峰形的改善效果，结果采用乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）为流动相，有效地改善了峰形，淫羊藿苷能达到理想分离。

4.3 实验过程

考察了不同提取溶剂（正丁醇、氯仿、乙酸乙酯）、提取次数（3 次、4 次、5 次）对结果的影响，结果以乙酸乙酯提取4 次为佳。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便，重复性良好，结果准确，具有专属性，更能真实地反映本品中淫羊藿苷的含量，可用于肾脾双补口服液的质量控制。