辽宁辽南地区庄河大骨鸡沙门菌病原分离、鉴定及药敏试验

张日欣 ， 范 强 ， 贺永明 ， 俞美子

(辽宁农业职业技术学院畜牧兽医系 ， 辽宁 营口 115009)

沙门菌是一种常见的人兽共患病原菌，不仅造成养殖户严重的经济损失，同时威胁着人类的食品安全，每年都有大量人群被感染，败血症或胃肠炎等是感染沙门菌的典型症状[1-3]。庄河大骨鸡是辽宁省培育的地方特色鸡群，其以体大敦实，觅食能力强，产蛋多且大，肉质鲜嫩等特点[4-5]。近几年，庄河大骨鸡饲养在辽南地区发展迅猛，规模化养殖场与日俱增，在感染庄河大骨鸡的众多病原菌中，沙门菌是较常见的致病菌，严重制约了庄河大骨鸡养殖产业的发展[6-7]。因此，对庄河大骨鸡中沙门菌的病原菌的分离、鉴定及药敏试验具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病料收集 于盖县、庄河、岫岩、辽阳等地区庄河大骨鸡养殖场中随机抽样选取鸡390只，取鸡的心脏、肝脏、肠道等组织器官作为被检材料，标号。

1.2 质控菌株 本次试验使用质控菌株为ATCC 14028，购自北京兰博瑞生物技术有限公司。

1.3 仪器与试剂 生物安全柜(NUAIRE公司)；全自动高压立式灭菌锅、恒温培养箱(上海申安医疗器械有限公司)；PCR扩增仪(美国伯乐BIO-RAD公司)；营养琼脂培养基、HE琼脂培养基、SS琼脂培养基、三糖铁培养基，均购自北京奥博星生物技术有限公司；各种细菌微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA提取试剂盒、2×PCR SuperMix、Marker 2 000 bp，均购自天根生物科技(北京)有限公司。

1.4 细菌的分离培养 无菌采集鸡的心脏、肝脏、肠道等组织器官，划线接种于无菌麦康凯琼脂培养基平板及SS琼脂培养基平板上，(36±1)℃培养24 h。 观察生长结果，选单个菌落继续纯化培养，保种用于后续鉴定。

1.5 显微镜观察 选取纯化培养后的单个菌落涂片进行革兰染色，镜检观察细菌形态。

1.6 生化试验 根据所购买的细菌生化鉴定管的说明书要求，对初步分离出来的沙门菌分离株依次接种于吲哚、丙二酸盐、邻硝基酚β-D-半乳糖昔(ONPG)、尿素、蔗糖、麦芽糖、尿素、甘露醇、乳糖等生化管中，经(36±1) ℃恒温培养24 h后观察结果。

1.7 药敏试验 选取单个的疑似菌落进行纯培养，将培养好的菌液均匀的涂抹于普通固体培养基上，用无菌镊子轻轻夹取各种药敏纸片轻轻贴于培养基表面。各个药敏纸片的中心距离应大于2.5 cm，每个药敏纸片距离平皿边缘的距离应该大于1.5 cm。 贴完后，将平皿倒置于恒温箱中，(36±1)℃培养24 h后观察，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)药敏标准进行判定。

1.8 血清型鉴定 参照GB 4789.4—2016《沙门氏菌检验》采用A～F多价O血清及单因子血清鉴定沙门菌的O抗原，根据O抗原及H抗原第1相和第2相反应结果进行血清分群和定型。

1.9 耐药基因检测 根据GenBank上发表的基因序列，经过查阅相关文献，结合软件Primer 5.0引物设计，设计3对引物用来扩增四环素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类代表性耐药基因。PCR反应体系20.0 μL：Premix TaqTM10.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，灭菌双蒸水7.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，51～55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃延伸8 min。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

表1 PCR扩增引物序列Table 1 Primer sequence of PCR amplification

2 结果

2.1 沙门菌的分离 培养24 h后，部分菌株在SS培养基可见黑色透明菌落，继续分离培养。麦康凯培养基可见无色菌落。经纯化、染色、镜检,确定为革兰阴性菌，镜检可见菌体短小、两端钝圆，多分散存在。初步判定分离株为沙门菌，共计51株。

2.2 沙门菌的生化鉴定 生化鉴定结果见表2。51株分离株中49株分离株对葡萄糖、赖氨酸脱氢酶、果糖、甘露醇结果呈阳性，对乳糖、鸟氨酸、蔗糖、尿素、吲哚试验呈阴性，与中国微生物菌种目录给出的沙门菌生化反应结果一致。本次试验中共检测样品390份，分离鉴定后得到49株沙门菌，分离率为12.56%。

表2 生化反应Table 2 Biochemical reaction

2.3 沙门菌药敏试验 结果显示，49株沙门菌株对12种抗生素的耐药率最高的集中在氟苯尼考，耐药率为87.76%。对四环素(77.55%)、青霉素(73.47%)、庆大霉素(71.43%)耐药率也较高。本试验分离鉴定后得出49株沙门菌对抗生素耐药情况见表3。

表3 药敏试验结果Table 3 Results of drug sensitivity test

对沙门菌进行多重耐药性分析，49株沙门菌均对12种抗菌药物有多重耐药性，结果见表4。其中表现2种或2种以上药物有多重耐药性，4耐菌株所占比例最大，占28.57%，多重耐药现象较为严重。分离株至少对2种药物耐药，并且表现为多重耐药性，表明在沙门菌病治疗时最好根据药敏试验结果，有针对性地科学用药，实际生产中可选用氟苯尼考、四环素、青霉素、庆大霉素等敏感药物。

表4 49株沙门菌的耐受抗生素种类分布Table 4 Distribution of resistant antibiotic species in 49 Salmonella strains

2.4 沙门菌分离株的血清学鉴定 49株沙门菌分离株经血清学鉴定后，共鉴定出4种血清型，其中鸡白痢沙门菌(1,9,12，-)为26株，占总沙门菌株的53.06%；其次，鼠伤寒沙门菌(1,4,5,12，i：1,2,)17株， 占总沙门菌株的34.69%；甲型副伤寒沙门菌(1,2,12，a：-)4株，占总沙门菌株的8.16%；曼哈顿沙门菌(6,8，d：1,5)2株，占总沙门菌株的4.08%。

2.5 耐药基因的检测 对49株沙门菌分离株的DNA进行PCR扩增，结果显示，blaTEM耐药基因检出率最高，42株(占85.71%)；其次为aadA1，32株(占65.31%)；tetB，27株(占55.10%)。3种耐药基因全部检出的分离株为22株(占44.90%)。见图1～3。

图1 耐药基因tetB PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of drug resistance gene tetBM：DL-2 000分子标记物； 1:阴性对照； 2、3、5、6:疑似沙门菌阳性样品； 4:疑似沙门菌阴性样品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2,3,5,6:Suspected Salmonella positive samples; 4:Suspected Salmonella negative samples

图2 耐药基因blaTEM PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of drug resistance gene blaTEMM：DL-2 000分子标记物； 1:阴性对照； 2:疑似沙门菌阴性样品； 3～6:疑似沙门菌阳性样品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples

图3 耐药基因aadA1 PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of drug resistance gene aadA1M：DL-2 000分子标记物； 1:阴性对照； 2:疑似沙门菌阴性样品； 3～6:疑似沙门菌阳性样品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples

3 讨论

沙门菌感染是一种常见的人兽共患疾病，可造成严重的经济损失，深深困扰着庄河大骨鸡的养殖户们，面对沙门菌感染的严峻形势，许多养殖户选择在养殖过程中大量使用抗生素，这使得沙门菌的耐药谱型迅速增宽[8-9]。有报道称，2018年华东地区共计分离出沙门菌71株，其中多重耐药率高达93.94%[10]。辽宁地区养殖场沙门菌分离率为20.73%，其中41.98%的分离株为3类及3类以上耐药菌株[11]。由此可见，禽源沙门菌耐药性的问题日趋严峻。

本试验对辽南地区庄河大骨鸡养殖户进行筛查，沙门菌分离率为12.56%，鸡沙门菌分离株为49株，鉴定出4种血清型，依次为：鸡白痢沙门菌，占53.06%；鼠伤寒沙门菌，占34.69%；甲型副伤寒沙门菌，占8.16%；曼哈顿沙门菌，占4.08%。耐药性最高的3种抗生素依次为氟苯尼考、四环素、青霉素，耐药率依次为87.76%、77.55%、73.47%。49株沙门菌对12种抗生素均有不同程度的耐药性，且均为多重耐药菌株。其中最少的耐药2种，最多耐药7种。表现2种或2种以上药物有多重耐药性，4耐菌株所占比例最大，占全部分离株的28.57%。耐药结果一定程度上表明辽南地区庄河大骨鸡沙门菌耐药的严峻性。造成这方面原因可能是：养殖户过度依赖抗生素，也可能是不同地区不同血清型的沙门菌对药物的耐受程度有差异，或者抗生素的应用剂量和方法的不科学[12-14]。在实际生产中对沙门菌病治疗时最好根据药敏试验结果，有针对性地科学用药，实际生产中可选用氟苯尼考、四环素、青霉素、庆大霉素等敏感药物。对耐药性较高的3种类型抗生素进行耐药基因的检测，blaTEM、aadA1、tetB三种耐药基因的检出率分别为85.71%、65.31%、55.10%。3种耐药基因全部检出的分离株为22株(占44.90%)。可见耐药基因的检出率与耐药情况关系密切，耐药基因的携带与耐药严重程度呈正相关，同时考虑到食用鸡肉抗生素的残留禁用情况，此次筛选没有选用氧氟沙星和恩诺沙星[15]。因此在庄河大骨鸡的养殖过程中，首先要做好种源沙门菌的净化，从源头上切断沙门菌的感染，同时应及时有效的对发病鸡群进行药敏试验，严格遵循药物使用流程，以达到科学饲养的目的。