狐源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的耐药基因型分析

冯 涛 ， 闫 爽 ， 薛 原

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150040)

大肠杆菌被认为是衡量食品粪便污染的一个指标，其耐药性和基因可以通过食物链转移给人类，这对公共卫生有潜在的风险[1]。β-内酰胺类药物是目前在临床上最为广泛使用的抗生素之一，超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum-β-lactamases, ESBLs)是一种由质粒介导传播的可以水解β-内酰胺类药物的水解酶[2]，由于抗生素的广泛甚至不正当使用，导致多种ESBLs的基因型产生，包括TEM、OXA、CTX-M和SHV等[3]。近年来，国外已有关于产ESBLs菌株引起疾病暴发流行的报道[4]，我国对这类大肠杆菌的检出率也在急剧增加[5]。

本试验检测和分析了东北地区不同狐源养殖场中ESBLs基因分布情况，旨在调查狐源中产ESBLs大肠杆菌的分子流行情况，为东北地区狐源养殖场的临床用药、预防和控制ESBLs基因的传播和流行提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠杆菌质控菌株(编号为ATCC25922)，由中国兽医药品监察所提供；试验菌株，于2016—2019年分离自东北不同地区狐养殖场，并分离纯化和鉴定为大肠杆菌，共224株。

1.2 试剂 药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；质粒小量提取试剂盒、DNA 片段凝胶回收试剂盒，均购自爱思进生物技术有限责任公司；水解酪蛋白琼脂培养基(Mueller-Hinton,MH)、琼脂糖，均购自西陇科学股份有限公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶、DL-2 000 marker、6×Loading Buffer、pMD18-T 载体、感受态细胞E.coliDH5α，均购自TaKaRa公司。

1.3 ESBLs耐药表型的测定 ESBLs耐药表型的检测采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)[6]推荐的双纸片法进行判定。初筛试验中，将试验用大肠杆菌均匀涂布于MH培养基，采用纸片扩散法，满足头孢他啶(CAZ)的抑菌直径≤22 mm或头孢噻肟(CTX)的直径≤27 mm，样本即可能为产ESBLs的菌株。进行确证试验，将试验用菌均匀涂布于MH培养基琼脂平板，贴头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/Clav)为1组，头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/Clav)为2组，共两组药敏纸片，若任一组药物的抑菌圈直径差≥5 mm，即可确定为产ESBLs的菌株。

1.4 ESBLs基因型的检测 按照参考文献[4,7-8]设计引物序列，TEM-F:GTATCCGCTCATGAGACAATA，TEM-R:AGAAGTGGTCCTGCAACTTT；CTX-M-F:GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG，CTX-M-R:CG TGCGAGTTCGATTTATTCAAC；SHV-F:TCTCCCTGTTAGCCACCCTG，SHV-R:CCACTGCAGCAGCTGCCG TT；OXA-F:GCAGCGCCAGTGCATCAAC，OXA-R:C CGCATCAAATGCCATAAGTG。对扩增出来的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳验证，胶回收纯化后与pMD18-T载体连接，并转入到感受态细胞E.coliDH5α中，将质粒样本送至吉林库美生物技术有限公司测序部进行序列测定，利用DNASTAR软件分析，与GenBank的数据库进行比较分析，确定基因型。

2 结果

2.1 ESBLs检测 224株狐源大肠杆菌在初筛试验中有178株为疑似产ESBLs菌株，经确证试验，178株疑似菌株均为产ESBLs菌株，占总菌株数的79.46%(178/224)。

2.2 ESBLs基因型的检测 在224株狐源大肠杆菌中，TEM、OXA、CTX-M型和SHV型基因扩增均出现阳性，扩增片段大小与预期目的片段相符，经测序可得，其同源性均在99%以上。

分别统计单独携带和复合基因型的检出情况，见表1。由表1可知，TEM、CTX-M、SHV和OXA阳性率依次为98.21%、75.45%、62.50%和93.30%，TEM和OXA为主要的ESBLs的基因型。同时检出4种基因型的比例最大，为47.32%，携带2个及2个以上基因型的大肠杆菌高达98.21%，没有单独携带CTX-M和SHV的情况。

表1 狐源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶基因携带情况及基因型Table 1 Detection of genotypes of ESBLs-producing Escherichia coli strains isolated from fox

3 讨论

抗生素在兽医临床用药和促进动物生长发育中起到重要的作用，但是由于抗生素的广泛使用或者使用不当等，导致细菌出现耐药性，甚至出现多重耐药菌。自首次发现产ESBLs菌株以来[9]，国内外各地检出ESBLs菌株的比例越来越大。其中产ESBLs菌株在大肠杆菌和克雷伯菌中报道最多[10]。尤其需要注意的是，编码β-内酰胺酶的基因大多位于质粒上，并且可以伴随质粒通过接合、转化和转导等在细菌种内甚至种间传播[11]，而且产ESBLs菌株所包含的质粒常常也携带着其他非ESBLs的耐药基因[12]，使耐药菌的扩散范围越来越广，为耐药菌的防控和兽医临床治疗造成了不可逆的影响。

在本次试验中对狐源大肠杆菌进行了ESBLs耐药表型的检测，有178株为产ESBLs的菌株，阳性率高达79.46%。对全部试验用大肠杆菌进行耐药基因型的检测，其中TEM的检出率最高，有220株大肠杆菌表现为具有TEM型，阳性率为98.21%。Fortini等[13]对尼日利亚的健康猪进行检测，同样以TEM为主要的ESBLs流行基因型。国外相关研究[14]也表明，ESBLs的基因型在由TEM向CTX-M转变。所有细菌都携带ESBLs耐药基因，超过95%以上的细菌携带2种及2种以上的耐药基因型，同时携带4种基因型的阳性率为47.32%，与曹敏等[15]报道的贵州部分地区猪源大肠杆菌ESBLs基因型的结果相似，这也证明了狐源大肠杆菌的ESBLs耐药基因型较为复杂，对药物极易产生耐药情况，并且对动物的临床治疗产生了困难。

由于毛皮动物的饲养在我国占据较为重要的地位，而对其耐药性和耐药基因的研究工作较少，开展ESBLs的检测和监控，用以防止多重耐药菌的扩散和暴发，对指导兽医临床用药具有一定的意义。了解ESBLs耐药基因的流行病学规律，可以有效的评估耐药性从动物扩散到环境甚至传播到人类的风险。建议采用联合用药或者抗生素替代的方式，避免耐药性的进一步扩散，减少耐药菌的公共卫生安全。