水解酶对杜仲叶黄酮提取的影响研究

◎陈书明

（1.三门峡职业技术学院食品园林学院；2.三门峡市生物技术重点实验室，河南三门峡 472000）

杜仲（Eucommia ulmoides），是杜仲科落叶乔木，是我国特有的名贵中药材[1]。2000多年以来，人们都是以杜仲皮入药[2]，因受产量限制杜仲皮在市场上供不应求。研究证实杜仲叶与杜仲皮有相似功效，2005年，杜仲叶被载入《中华人民共和国药典》,2018年纳入药食两用物质管理。杜仲叶主要药理作用为降血压、降血脂、降血糖、抗炎抗病毒、抗疲劳、强筋健骨、抗衰老等[3]。杜仲叶中含有丰富的营养物质，包括：VB1、β-胡萝卜素，17种游离氨基酸，锗、硒等15种微量元素，大约10%—20%的蛋白质。杜仲叶还含有丰富的活性成分，包括黄酮类、多糖类及杜仲橡胶等。目前，人们对杜仲叶的开发利用进行了研究，并研制出一系列杜仲叶新产品，其中利用杜仲叶制成的杜仲茶受到了广泛的欢迎[4]。常见的杜仲速溶茶提取方法有水提法和有机溶剂法。这两种方法的缺陷分别是杜仲叶中的活性成分溶出有限和提取物中存在有机溶剂残留[5]。

酶制剂作为生物制剂，具有天然、绿色、安全、无污染等特点，被广泛应用于食品加工的各个领域。纤维素酶能将杜仲叶片的纤维素分解，提高营养成分和活性成分的溶出。另外，杜仲叶中的粗蛋白只有1%-2%是可溶于水的，常规提取方法蛋白质的溶出率低，外用蛋白酶能将杜仲叶中蛋白质解转化为氨基酸，不仅可以提高杜仲叶及杜仲叶蛋白的利用价值，还可以提高和改善水浸出物品质。果胶酶主要作用于杜仲叶细胞壁中的果胶，通过果胶水解，从而破坏由蛋白质、茶多酚和果胶等碳水化合物物形成的悬浮颗粒的稳定体系，使得茶汤澄清。单宁酶可以水解单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。可以防止单宁分子中含有的酚羟基在多酚氧化酶存在的条件下被氧化，生成具有颜色的邻醌，这种物质会加深产品的色泽[6]。另外现有研究表明，添加外源单宁酶可以在一定程度上降低产品苦涩味，从而提高产品的鲜醇度[7]。目前，人们对单一酶制剂在杜仲叶提取中的作用进行了研究，但复合酶制剂对杜仲叶的作用效果鲜少报道。

本研究以杜仲叶为原料，通过水解酶提取杜仲叶内成分，以黄酮含量为指标来反映酶制剂在杜仲叶提取时的效果，以期获得提取率高、品质好的杜仲叶浸出产品，为杜仲茶生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

杜仲叶，灵宝帅华牧业有限责任公司提供；芦丁（纯度≥95.0%），北京来莱宝技有限公司提供；中性蛋白酶（酶活≥40万U/g）、果胶酶（酶活≥120万U/g）、纤维素酶（酶活≥1万U/g）、单宁酶（酶活≥10万U/g），佳味源实业有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 仪器与设备

LH-08B连续流粉碎机，长沙市中胜制药机械厂；HA-4数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制器有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法与步骤

1.3.1 提取工艺流程

杜仲叶→干燥→粉碎→酶解浸提→过滤去渣→测定活性成分含量

1.3.2 操作要点

（1）7月份采摘杜仲叶片相关参照文献晾晒3-4天后240℃杀青[7-8]；

（2）取经杀青处理的杜仲叶片，根据前期试验结果粉碎成40-80目，然后迅速置于自封袋，在阴凉处遮光保存；

（3）以杜仲叶粉末质量计，蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、单宁酶用量均设0.05%、0.10%、0.15%、0.20%4个梯度。制成杜仲叶水比为1∶50的混合液，35℃、45℃、55℃水浴加热30min以未加酶制剂的为对照，同时做3组平行试验；

（4）水浴后的样液加1.5倍沸水，趁热减压过滤；

1.3.3 黄酮含量测定参照相关文献[8-9]

绘制标准曲线 精密称取芦丁标准品10mg，用60%的乙醇溶解，超声波助溶，定容至100mL，及配置成100μg/mL的标准溶液。取标准溶 液0.50、0.75、1.00、1.30、1.50、1.80、2.00mL定容至10mL，400nm处分别测量其吸光度。以溶液的吸光度为纵坐标，黄酮的浓度为横坐标作黄酮标准曲线图，标准曲线见图1。

图1 黄酮的标准曲线图

线性回归得到计算公式为：y=0.225x（y为吸光度，x为浓度）R2=0.999。

1.4 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上各取3个水平进行L9（34）正交设计试验，正交设计因素和水平见表1。

表1 正交设计因素和水平

2 结果与分析

2.1 蛋白酶对黄酮量的影响

蛋白酶对黄酮含量影响见图2。

图2 蛋白酶添加量与黄酮含量之间关系

图2显示，各处理温度条件下，随着蛋白酶添加量的增加黄酮呈先升高后降低趋势，添加同剂量的酶制剂，35℃条件下的黄酮含量均高于45℃、55℃，这说明35℃是蛋白酶的最佳使用温度。由图5可知，35℃条件下蛋白酶添加量0.15%时黄酮含量最大，为9.51mg/g。因此，蛋白酶的最佳使用条件是添加量0.15%、温度35℃。

2.2 果胶酶对黄酮含量的影响

果胶酶对黄酮含量影响见图3。

图3 果胶酶添加量与黄酮含量之间关系

由图3可知，各处理温度条件下，随着果胶酶添加量增加处理组黄酮含量呈先上升后降低趋势，且均高于对照，说明适当的果胶酶添加是有利于黄酮浸出和扩散的。由图3可知，果胶酶的最佳使用条件是添加量0.10%、温度35℃。

2.3 纤维素酶对黄酮含量的影响

纤维素酶对黄酮含量的影响见图4。

图4 纤维素酶添加量与黄酮含量之间关系

由图4可知，各处理温度下，随着纤维素酶添加量增加处理组黄酮含量呈先上升后降低趋势，且温度越高，同剂量酶制剂条件下黄酮含量越高，说明适当的提高温度有利于黄酮的浸出。由图8可知，纤维素酶的最佳使用条件是添加量0.15%、温度55℃。

2.4 单宁酶对黄酮含量的影响

单宁酶对黄铜含量的影响见图5。

图5 单宁酶添加量与黄酮含量之间关系

图5显示，35℃、45℃条件下，处理组黄酮含量随着单宁酶添加量增加呈先升高后降低趋势；45℃条件下各处理组黄酮含量均低于对照组，说明此温度下添加单宁酶对于黄酮浸出和扩散时不利的；由图5可知，单宁酶的最佳使用条件是添加量为0.05%、温度35℃。

2.5 复合酶制剂对杜仲叶黄酮提取效果的影响

由单因素处理结果可知：4个处理结果中最适温度条件为35℃有3个，最适温度为55℃的有1个，考虑到进经济成本确定复合酶制剂的最佳使用温度定为35℃。单因素试验时发现，果胶酶处理后过滤难度非常大，因为酶制剂之间存在协同增效作用，氢正交试验时单宁酶的最大添加量设定为0.05%。复合酶制剂处理结果如表2。

根据表2可知，影响黄酮含量的因素主次排序为：蛋白酶＞单宁酶＞纤维素酶＞果胶酶，蛋白酶对黄酮含量影响最大，其次是单宁酶。蛋白酶最佳添加量为0.15%，纤维素酶为0.15%，单宁酶为0.01%，果胶酶为0.05%。试验过程中发现，使用复合酶制剂处理时，酶解后过滤难度比除果胶酶外的其他单一酶制剂大，但是比单一果胶酶难度要小很多。

表2 正交试验结果

按照100g杜仲叶添加蛋白酶0.15g、果胶酶0.05g，纤维素酶0.15g、单宁酶0.01g进行验证试验，该复合酶制剂能提高杜仲叶成分的提取率。

3 结论

通过单因素试验，查明复合酶制剂有利于杜仲叶黄酮的提取；通过正交试验，确定在35℃条件下，酶制剂对提取效果影响的主次因素排序为：蛋白酶＞单宁酶＞纤维素酶＞果胶酶；添加蛋白酶0.15%、果胶酶0.05%，纤维素酶0.15%、单宁酶0.01%时，杜仲叶黄酮含量为9.69mg/g，高出对照组23.28%，实现了提高杜仲资源利用率的目的。