一次性使用卫生用品口罩中绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的分析

赵阳，游元丁，李跃红，陈露，林雪丹，冉茂乾，焦彦朝

（1.六盘水市口岸服务中心，贵州六盘水 553000;2.国家果蔬检测重点实验室，贵州六盘水553000;3.贵阳海关综合技术中心，贵州贵阳 550081）

CNAS-RL02:2018《能力验证规则》中说明能力验证是实验室重要的外部质量控制活动，参与能力验证活动是除现场评审以外，可以证明实验室在相关检测领域具有检测能力的一种方式[1-2]。参与能力验证活动可通过对人员能力、检测方法、设施场所和仪器设备等方面判断实验室是否具有满足相关检测活动的需求[3]。中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）将能力验证结果的满意度评价作为实验室能力判断的一项重要依据[4-5]。因此，参与能力验证活动对检测实验室具有重要意义。

新型冠状病毒主要经呼吸道飞沫和密切接触传播[6]，国家卫生健康委员会印发的《预防新型冠状病毒感染的肺炎口罩使用指南》[7]指出，口罩可以降低被新型冠状病毒感染的风险。口罩不仅可以防止已被感染新型冠状病毒的病人喷射飞沫，同时降低飞沫量和喷射速度，还可以阻挡外部含病毒的飞沫核，防止他人吸入。目前，口罩成为大众预防新型冠状病毒的首要防疫用品，因此，相关检测实验室对口罩质量的把关极为重要。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，又称铜绿假单胞菌）是两种常见的“化脓性致病菌”。金黄色葡萄球菌在临床上主要引起皮肤及软组织化脓性感染、上呼吸道感染等[8]；在烧伤、外科创伤手术后使用受绿脓杆菌污染的卫生用品可引起局部化脓感染[9]。口罩直接接触人体的皮肤或粘膜，关系到使用者的身体健康安全，医用防护口罩技术要求规定微生物指标绿脓杆菌与金黄色葡萄球菌不得检出[10]。为此，本实验室参照一次性使用卫生用品卫生标准[11]及一次性使用卫生用品中致病菌的检测参试指导书参与了由国家市场监督管理总局组织的2020年国家级能力验证活动，确保检测人员具有检测一次性使用卫生用品中致病菌的技术能力，同时提高防疫防护用品的检测技术。

1 材料与方法

1.1 样品信息

样品为真空西林瓶包装的含菌口罩，购自北京海关；绿脓杆菌检测样品编号为20DP-2803、20DP-0126；金黄色葡萄球菌检测样品编号为20DP-1248、20DP-1709。

1.2 培养基及试剂

SCDLP 培养液、十六烷三甲基溴化铵琼脂、血琼脂平板、营养琼脂（NA）、Baird-Parker 平板、绿脓菌素测定培养基、硝酸盐胨水培养基、甘露醇培养液、冻干血浆、明胶等培养基及生化试剂管均购自北京陆桥，已进行相关验收且在有效期内；VITEK2 革兰氏阳性（GP）细菌鉴定卡，购自生物梅里埃公司且在有效期内。

1.3 试验方法

1.3.1 制备待测样液

根据参试指导书要求，在生物安全柜内无菌操作打开西林瓶，瓶内样品为口罩实物样品，可直接用于检测，无需再次称量。使用灭菌剪刀将口罩剪碎后加入100 mL 灭菌生理盐水中，充分混匀，得到生理盐水样，即为待测样液。

1.3.2 绿脓杆菌检测方法

取样液5 mL，加入50 mL SCDLP 培养液中，充分混匀，于（35±2）℃培养18～24 h，从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种CN 平板、十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置（35±2）℃培养18～24 h，观察菌落特征。挑取可疑菌落划线接种营养琼脂进行纯培养，于（36±1）℃培养18～24 h，采用全自动微生物鉴定仪（VITEK 2 COMPACT）进行鉴定。同时挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阴性菌者，进行生化试验。

1.3.3 金黄色葡萄球菌检测方法。

取样液5 mL，加入50 mL SCDLP 培养液中，充分混匀，于（35±2）℃培养18～24 h，取增菌液划线接种血琼脂平板及Baird-Parker 平板。挑取可疑菌落划线接种营养琼脂进行纯培养，于（36±1）℃培养18～24 h，采用全自动微生物鉴定仪（VITEK 2 COMPACT）进行鉴定。同时挑取典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性球菌者，进行生化试验。

2 结果与分析

2.1 绿脓杆菌检测结果

2.1.1 培养液特征及平板上菌落形态

如表1 所示，将样液加入到SCDLP 培养液中，36 ℃培养24 h 后可观察到培养液呈黄绿色，有一层薄菌膜。从薄菌膜处挑取培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板、CN 平板。样品编号20DP-0126 和20DP-2803 挑取的培养物在十六烷三甲基溴化铵平板上生长良好，菌落扁平，边缘不整；在CN平板上为圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，紫外光照射下观察有荧光，菌落形态均为典型绿脓杆菌菌落特征。

2.1.2 生化鉴定

挑取可疑菌落进行革兰氏染色，20DP-0126 和20DP-2803 样品镜检结果均为革兰氏阴性杆菌，并进行相应的生化试验。表2 结果显示，氧化酶试验阳性、绿脓杆菌毒素试验阳性、硝酸盐还原产气阳性、明胶液化阳性、42 ℃生长试验阳性，符合典型绿脓杆菌生化特征。20DP-0126 和20DP-2803 口罩样品检测结果均为绿脓杆菌检出。

表1 绿脓杆菌口罩样品菌落形态表

表2 绿脓杆菌口罩样品生化鉴定结果表

2.2 金黄色葡萄球菌检测结果

2.2.1 培养液特征及平板上菌落形态

SCDLP 培养液经36 ℃培养24 h 后培养基变浑浊，挑取培养物划线接种血平板、Baird-Parker 平板。如表3 所示，样品编号20DP-1248、20DP-1709 在血琼脂培养基上菌落特征为金黄色、大而突起、圆形、不透明、表面光滑、周围有溶血圈；在Baird-Parker 平板上菌落特征为黑色、表面光滑、凸起、湿润有光泽、浅色边缘外有一清晰带。菌落形态在血琼脂平板与Baird-Parker 平板上均为典型金黄色葡萄球菌菌落特征。

表3 金黄色葡萄球菌口罩样品菌落形态表

2.2.2 生化鉴定

挑取可疑菌落进行革兰氏染色，20DP-1248 和20DP-1709 样品镜检结果均为革兰氏阳性葡萄球菌，并进行相应的生化试验。表4 结果显示，甘露醇发酵试验阳性、血浆凝固酶试验阳性，20DP-1248 和20DP-1709 口罩样品检测结果均为金黄色葡萄球菌检出。

表4 金黄色葡萄球菌口罩样品生化鉴定结果表

2.3 全自动微生物生化系统鉴定

分别从每个样品不同平板上挑取3 个可疑菌落划线接种营养琼脂，使用纯培养物进行全自动微生物生化系统VITEK2 鉴定。20DP-0126、20DP-2803可疑菌落纯培养后均鉴定为99%概率为绿脓杆菌；20DP-1248、20DP-1709 可疑菌落纯培养后均鉴定为99%概率为金黄色葡萄球菌。VITEK2 鉴定结果均与传统生化反应鉴定结果相符合。

3 结论

参考文献：

[1] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-RL02:2018 能力验证规则按照一次性使用卫生用品卫生标准及能力验证参试指导书进行检测，结果表明，20DP-0126、20DP-2803 检出绿脓杆菌，20DP-1248、20DP-1709检出金黄色葡萄球菌。[S].2018.

[2] 赵阳,游元丁,冉茂乾,等.一例志贺氏菌测量审核分析[J].安徽农业科学,2020,48(8):201-203.

[3] 任敏红,依力哈木·尔西丁,王兴华,等.能力验证在检测实验室质量管理中的应用[J].中国检验检测,2019,27(2):58-60,23.

[4] 刘颖,薛靓.测量审核的实施方法及满意度评定[J].中国测试,2012,38(S1):107-110.

[5] 区伟珍. 浅谈实验室质量控制的方法[J]. 广东化工,2015,42(7):116,83.

[6] 国家卫生健康委员会办公厅,国家中医药管理局办公室.关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)的通知 国卫办医函〔2020〕184 号[EB/OL].(2020-03-03)[2021-04-12]http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-03/04/content_5486705.htm.

[7] 国家卫生健康委员会.关于印发新型冠状病毒感染不同风险人群防护指南和预防新型冠状病毒感染的肺炎口罩使用指南的 通 知[EB/OL].(2020-01-30)[2020-04-12]http://www.gov.cn/xinwen/2020-01/31/content_5473401.htm.

[8] 范陈良,李小四,吴晓燕.皮肤及软组织感染中金黄色葡萄球菌临床分布和耐药特性分析[J].中国抗生素杂志,2017,42(5):413-417.

[9] 韩青松,简永利,涂宜强,等.绿脓杆菌研究进展[J].畜牧与饲料科学,2012,33(1):122-124.

[10] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB 19083-2003 医用防护口罩技术要求[S].北京:中国标准出版社,2003.

[11] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.中国国家标准化管理委员会.GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准[S].2002.