酸奶发酵促进剂的研究

田露露

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海201700）

酸奶适合乳糖不耐受人士饮用[1-2]。普通酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，通过保加利亚乳杆菌（德氏乳杆菌保加利亚亚种）和嗜热链球菌发酵产生的[1-3]。酸奶发酵过程中加入益生菌、益生元或者不同的植物提取物，可以产生营养、味感、物理化学和流变学特性不同的功能性酸奶。研究表明，番茄汁、维生素、糖、酪蛋白水解物、抗氧化剂、酶、矿物质、氨基酸（如L-半胱氨酸）、谷物、蔬菜、水果、浓缩乳清蛋白和酵母抽提物可以通过提供嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌必需的营养因子和适当的条件（pH、氧化还原电位）来提高细菌生长速度[1,3-5]。表面活性剂对发酵的促进作用也有报道[6]，而单硬脂酸甘油酯（简称单甘酯）在酸奶发酵中一般是作为乳化剂和增白剂[7]。

酸奶发酵过程中，pH 和滴定酸度对益生菌的活力和代谢特征有较大的影响。在低pH 时（＜4.5），需要大量能量维持细胞内pH，从而会导致ATP 的不足[1]。酸奶发酵的pH 对酸奶粘度和硬度等质构也有一定的影响[8]。因此，本文在酸奶发酵过程中添加酶、乳化剂、抗氧化剂、生长因子等物质，监测pH、酸度、质构和风味等指标，推测这些物质能否促进酸奶发酵，以减少不良因素引起的发酵速度异常。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发酵剂及奶粉

不同比例的发酵剂型号（GF359、GF377、GF686、GF931）由不同比例和菌株的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌混合而成，其中第一个阿拉伯数字代表产品的粘度，数字越大，粘度越大；第二个阿拉伯数字代表产品的产酸速度（产品发酵终点pH 4.5 左右时间为依据），数字越大，产酸速度越快；第三位数字代表产品后酸化情况（产品发酵结束冷藏12 h 后酸度增加值为依据），数字越大，后酸化越弱。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌由润盈生物工程（上海）有限公司提供。全脂奶粉，新西兰恒天然集团。

1.1.2 酶、乳化剂及生长因子

胰蛋白酶（Trypsin，简称胰酶），sigma-aldrich；木瓜蛋白酶（Papain，简称木瓜酶），sigma-aldrich，≥10 units/mg protein；菠萝蛋白酶（bromelain，简称菠萝酶），sigma-aldrich，≥3 units/mg protein；β-D 半乳糖苷酶（β-galactosidase)，sigma-aldrich，≥0.15 units/mg protein；酪蛋白水解物（Casein acid hydrolysate），sigma-aldrich；番茄粉（tomato powder），道勤生物科技（上海）有限公司；L-半胱氨酸（L-cysteine），sigma-aldrich；单甘脂（glyceryl monooleate），sigma-aldrich； 维生素C（Ascorbic acid)，sigma-aldrich；酵母粉（yeast)，北京奥博兴生物科技有限公司；鸟苷酸二钠（disodium guanylate），sigma-aldrich；D 葡萄糖酸钠（sodium gluconate），沪试；酵母抽提物FM802（yeast extract），安琪；无水硫酸镁，六水氯化镁，沪试。

1.2 实验仪器

BSA2202S 电子天平，Sartorius；G20 自动滴定仪、Five Easy pH 计，Mettler Toledo；HH-W600 水浴锅、数显恒温三用水箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式灭菌锅，上海申安医疗器械厂；D2025W 电动搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；APV-1000 高压均质机，汉默泰克（北京）流体技术有限公司；BCD-268WBC 立式冷藏陈列柜，Haier。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制备

95 g 奶粉加纯净水，定量至1 L；加热至60～65 ℃，高速搅拌溶解15 min；65～70 ℃、20 MPa 条件下均质后于95 ℃条件下杀菌5 min；冷却至42～43 ℃，接菌并于42～43 ℃温度下发酵4～6 h；继续42～43 ℃培养至滴定酸度不低于70°T，降温至20～25℃，灌装，置于1～4 ℃冷藏约12 h 后检验。

1.3.2 酸奶pH 及酸度的测定

酸奶pH 用pH 计测定，酸度采用滴定法测定。测量酸度时，取样品5 mL，加入20 mL 蒸馏水，采用NaOH 标准溶液（约0.1 mol/L）滴定至微红色，30 s不褪色即为滴定终点，所用的NaOH 的毫升数乘以20，即得出吉尔涅尔度（°T)。

1.3.3 酸奶发酵的影响因素

酸奶发酵的影响因素有：菌种关系及比例（不同的发酵剂）[8-9]、发酵促进剂（抗氧化剂等）的添加及对水分活度的影响[1,9-10]、酶的添加[9,11-12]、乳化剂的添加[5-6]、生长因子的添加等[3-4,10]。本文比较不同的发酵剂（GF931、GF686、GF359、GF377）对发酵差别的影响，以及添加抗氧化剂（维生素C、L-半胱氨酸）、酶（β-半乳糖苷酶、菠萝酶、木瓜酶、胰酶）、乳化剂（单甘酯）、生长因子（酪蛋白水解物、番茄粉、酵母粉、酵母抽提物）、鸟苷酸二钠、葡萄糖酸钠等对发酵酸度、pH、质构的影响。

2 结果与分析

2.1 生长因子对酸奶发酵pH 的影响

乳酸菌的快速增殖会产酸，降低体系的pH。有研究表明，在培养基中分别添加番茄汁、缓冲盐碳酸钙、啤酒、CaCl2、麦芽汁、胡萝卜汁等，对菌体的生长有促进作用[3-4]，而抗氧化剂（维生素C、L-半胱氨酸）的添加可能在维持益生菌细胞中有效[1,10]。本研究在酸奶发酵过程中（发酵剂GF931）添加生长因子（酪蛋白水解物、番茄粉、酵母粉）和抗氧化剂（L-半胱氨酸、维生素C）、乳化剂（单甘酯）、鸟苷酸二钠、葡萄糖酸钠进行比较实验，结果如图1 所示。番茄粉、酪蛋白水解物、维生素C、酵母粉对pH 的影响较大，这可能是因为酪蛋白经水解后富含氨基酸和肽类，可以更好地促进菌体生长，提高了菌体的产酸能力；而番茄粉对酸奶发酵的促进作用进一步证实了张兰威等人[3]的研究，即番茄汁可以促进保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长；酵母粉含有大量氨基酸，可以促进菌体生长，因而可以提高酸奶的发酵速度。相比较而言，单甘酯和L-半胱氨酸对pH 降幅也有一定的增加作用，鸟苷酸二钠和葡萄糖酸钠则能减缓pH的下降。

图1 生长因子添加对酸奶发酵pH 的影响（发酵剂GF931）

2.2 酶添加对酸奶发酵质构的影响

蛋白质种类和含量、脂肪含量是决定酸奶质构的基础[5]，此外，胞外多糖的产生也会对酸奶的粘度及质构产生影响[8]。酶的添加会改变蛋白质的组成和比例，因而会对酸奶质构产生影响。研究发现，同种蛋白质经过不同的蛋白酶水解后其水解物中各氨基酸和肽的含量和种类差异均较大，不同蛋白质的水解物能提供的氨基酸的种类和含量也有差异，因而不同酶的水解物对酸奶发酵剂的促进作用有差异[11]。

两种酶（木瓜酶、菠萝酶）的添加对酸奶发酵质构的影响见图2。实验表明，酶解处理的牛奶发酵的酸奶的物理性质变化很大，不同的酶产生的效果也有差别。当木瓜酶添加量为10 mg/L 和20 mg/L 时，对发酵剂GF931 发酵的酸奶质构影响不大；而当其添加量增加至40 mg/L 时，1 h 开始凝块，4 h 严重析出乳清。菠萝酶添加2 mg/L 时，3 h 即开始凝块有乳清；而添加量8 mg/L 时，发酵3 h 则严重凝块有乳清。

图2 酶添加对酸奶发酵质构的影响（发酵剂GF931）

2.3 发酵促进剂相同添加量比较实验

表1 为添加量30 mg/L 的单因素实验结果（发酵剂GF931）。从表1 可以看出，除了L-半胱氨酸和MgSO4会使发酵乳口感异常，其他因素均对发酵乳的口感没有明显影响，菠萝酶对发酵产品的质构影响较大，状态比较差，其他发酵促进剂的发酵后状态均为良好。β-半乳糖苷酶的添加反而使发酵后pH 增加，这可能是由于这种酶对牛奶中的蛋白分解能力不强或者其分解的产物不能够被乳酸菌所利用造成的。因此，虽然β-半乳糖苷酶细胞内可以分解乳糖，菌体外添加并没有对发酵有明显的促进作用。

表1 单因素实验结果

2.4 综合因素对不同发酵剂的影响

图3 pH 和酸度随发酵时间的变化

为了比较酶和生长因子混合添加对酸奶发酵过程中酸度和pH 的影响，采用发酵活性较高的发酵剂GF686，添加不同含量的木瓜酶和酵母抽提物，并记录对酸奶发酵pH 和酸度的影响，结果见图3。结果表明，滴定酸度逐渐增大，原因可能是菌体的增殖产生酸性物质，如蛋白质经过酶水解产生的氨基酸和短肽增加了嗜热链球菌的产酸能力[11]。虽然木瓜酶和酵母抽提物的添加能够在一定程度上提高酸奶发酵速度，但总体来讲，促进效果不明显，且无剂量依赖性。因此，虽然木瓜酶和酵母抽提物在单因素实验中对发酵促进效果明显，此发酵促进剂对发酵活性相当高的发酵剂GF686 并无明显作用。

表2 为3 种发酵剂（GF359、GF377、GF686）中，分别添加混合生长因子Ⅰ（木瓜酶1 mg/L ＋胰酶1 mg/L ＋酪蛋白水解物10 mg/L ＋番茄粉10 mg/L ＋酵母抽提物7 mg/L ＋单甘脂1 mg/L）、生长因子Ⅱ（10 mg/L MgCl2）、生长因子Ⅲ（30 mg/L MgCl2）对发酵的影响。从表2 可以得出，组合Ⅰ对发酵活性偏低的发酵剂GF359 有明显的发酵促进作用而对发酵活性中等的发酵剂GF377（medium）和发酵活性高的发酵剂（GF686）均无明显发酵促进作用。MgCl2对发酵活性低的发酵剂GF359 也无明显促进作用。

表2 不同发酵剂发酵差别比较

3 结论

在酸奶发酵过程中添加生长因子番茄粉、酪蛋白水解物、酵母粉、酵母抽提物以及抗氧化剂维生素C对发酵pH 的变化影响较大，而乳化剂单甘酯、抗氧化剂L-半胱氨酸对发酵酸奶的pH 影响不大；菠萝酶和β-半乳糖苷酶对pH 影响不大，木瓜酶对pH影响显著；鸟苷酸二钠和葡萄糖酸钠则减缓发酵速度。木瓜酶和菠萝酶在高剂量时对酸奶质构有不良影响；L-半胱氨酸和MgSO4会对酸奶发酵味道产生异味。通过联合配比酶、生长因子和乳化剂，可以得出发酵促进剂的最佳多因素组合，从而在不影响酸奶质构和口感的前提下，达到最优促发酵效果。发酵促进剂对发酵活性较高的发酵剂并无明显作用，而对发酵活性较低的发酵剂有明显促进作用。