转录因子E2F1 及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立

安娇，朱长军，王雅洁*

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

转录因子E2F1 最早是在研究腺病毒E2 启动子的过程中发现的[1]，是E2F家族中被研究最多的成员。研究表明，E2F1 通过转录调控各种下游关键靶基因的表达参与各种基本细胞生命活动过程，是细胞增殖和细胞凋亡的关键调控因子。一方面，E2F1 参与了细胞周期从G1 期到S 期的转换[2]；另一方面，E2F1还通过p53 依赖型以及p53 非依赖型两种细胞信号通路发挥促凋亡功能[3]。E2F1 在乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中高表达，并通过影响细胞凋亡、血管生成、肿瘤转移侵袭和细胞耐药等进程来促进肿瘤的发生发展[4-5]。但是E2F1 在肿瘤细胞中的作用机制仍不完全清楚。

在人体内，转录因子E2F1 位于染色体20q11，片段长度约11 kb，编码437 个氨基酸组成的蛋白质。E2F1 主要功能域包含cyclin A 结合功能域、DNA 结合功能域、DP 结合功能域、Marked box 功能域、转录激活功能域和Rb 结合功能域。

本研究构建了真核细胞表达质粒pFlag-E2F1 及其DNA 结合功能域突变体质粒pFlag-E2F1E132，并进一步获得了与之对应的稳筛细胞株。这些细胞株对E2F1 的关键下游靶基因的筛选具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

HeLa 细胞和pFlag 真核细胞表达载体由天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室提供；pCMV-E2F1 表达质粒由中国科学院水生生物研究所生物多样性与水生生物保护重点实验室馈赠。

1.2 试剂与仪器

胎牛血清、DMEM细胞培养基，Biological Industries公司；Lipofectamine 3000 转染试剂，Thermo Fisher Scientific 公司；高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪公司；Flag 抗体、Actin 抗体、Tubulin 抗体，Sigma 公司；二抗HRP，Invitrongen 公司。

Eclipse TS100 倒置荧光显微镜，Nikon 公司；Steri-Cycle 直热式Forma CO2细胞培养箱，Thermo公司；Mini P4 小型蛋白电泳仪，Bio-Rad 公司；5417R 小型台式高速冷冻离心机，Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 pFlag-E2F1 真核细胞表达质粒的构建与鉴定

通过查询真核细胞表达质粒pCMV-E2F1 和真核细胞表达载体pFlag 的质粒图谱，酶切获得目的片段E2F1 和载体pFlag，然后用T4 DNA 连接酶进行连接，得到pFlag-E2F1 重组质粒，小提质粒后测序。

1.2.2 Flag-E2F1 的DNA 结合功能域突变体质粒的构建

在E2F1 DNA 结合功能域的关键位点[6]处设计点突变引物。上游：5'-CACGCTATGAGACCTCAGA ATCCCTGACCACCAAGCGCTTC-3'，下游：5'-GAA GCGCTTGGTGGTCAGGGATTCTGAGGTCTCATAGCG TG-3'。以pFlag-E2F1 质粒为模板进行点突变PCR。在PCR 产物中加入限制性核酸酶Dpn Ⅰ，去除被甲基化的模板质粒。小提质粒后送往金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.3 质粒转染及稳筛细胞株的构建

在24 孔板中接种宫颈癌细胞HeLa，24 h 后用Lipofectamine 3000 转染试剂分别转染pFlag-E2F1 和pFlag-E2F1E132质粒，继续培养48 h。通过Western blot 检测Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白的表达。同时，分别将对应细胞转移至10 cm 培养皿，用G418（750 μg/mL）进行筛选，挑取单克隆。通过Western blot 检测，将能表达Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的单克隆细胞扩增，得到稳定表达Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白的稳筛细胞株。

2 结果与分析

2.1 真核细胞表达质粒pFlag-E2F1 及其突变体质粒pFlag-E2F1E132 的构建

首先通过双酶切获得载体pFlag 和目的片段E2F1，然后用T4 DNA 连接酶进行连接，得到重组质粒pFlag-E2F1。经测序鉴定，pFlag-E2F1 质粒序列无误。

如图1a 所示，以pFlag-E2F1 为模板，通过点突变PCR 的方式将E2F1 DNA 结合功能域的第132 位亮氨酸（L）和133 位天冬酰胺（N）分别替换为谷氨酸（E）和丝氨酸（S），使其失去DNA 结合能力[6]。经过细菌转化、小提质粒后测序鉴定。如图1b 所示，与pFlag-E2F1 序列比对，突变体质粒pFlag-E2F1E132序列成功突变。

图1 质粒pFlag-E2F1 和质粒pFlag-E2F1E132 的构建

2.2 Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132 稳定表达细胞株的构建

在HeLa 细胞中分别转染pFlag-E2F1 和pFlag-E2F1E132质粒，48 h 后将细胞转移至10 cm 平皿，用含有750 μg/mL G418 的DMEM 培养基进行筛选，挑取单克隆。用Western blot 和免疫荧光染色的方法进行检测，如图2 所示，Flag-E2F1 单克隆的#6 细胞株和Flag-E2F1E132单克隆的#2 细胞株分别稳定表达Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132蛋白且免疫荧光染色显示这两种蛋白均定位于细胞核内，表明稳定表达Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的细胞株构建完成。

图2 Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132 稳定表达细胞株的构建

3 结论

本课题构建了真核细胞表达质粒pFlag-E2F1 及其突变体质粒pFlag-E2F1E132，在此基础上构建了稳定表达Flag-E2F1 和Flag-E2F1E132的HeLa 细胞株。这些细胞株的构建有助于进一步通过ChIP 实验筛选转录因子E2F1 下游关键靶基因，为深入研究E2F1在细胞不同生命活动中的作用机制奠定基础。