b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a与慢性乙型肝炎肝纤维化程度的相关性

李园园 苏峰 王艳 栾兴龙★

作者单位：1.济宁医学院附属湖西医院消化内科，山东，菏泽274000

2.单县中心医院消化内科，山东，菏泽274000

慢性乙型肝炎（chronic viral hepatitis B，CHB）主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）长期感染引起，是世界范围内的重大公共卫生问题之一。CHB 病程较长时可引起患者肝细胞损伤，并使肝脏出现纤维化甚至肝硬化［1］。肝硬化是诱发肝癌最常见的原因，相关研究显示，通过对慢性乙肝患者不同肝纤维化程度进行区分诊断，及时监测肝纤维化进展，进行恰当的干预可使疾病进展减缓或稳定在一定阶段，对延长慢性乙肝患者的生存时间和改善生活质量有重要意义［2］。在CHB患者肝细胞破坏、肝纤维化形成的过程中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b⁃FGF）和转化生长因子⁃β1（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β1）的作用逐渐受到关注［3］。此外，微小RNA（microRNA，miRNA）作为重要的调控分子，是分子水平上监测疾病进展的敏感指标［4］。miR⁃34 家族包含由两种不同基因编码的三个microRNA：miR⁃34a、miR⁃34b 和miR⁃34c。近年来，miRNA⁃34 家族在CHB 中的表达异常为肝纤维化的诊断等提供了新靶点［5］。本研究通过分析b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a 在CHB 患者中的表达情况，旨在探讨三者联合对肝纤维化诊断、病情评估的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 基线资料

选取2018年9月至2020年9月本院收治的180 例CHB 患者作为CHB 组，其中男性92 例，女性88 例，年龄平均（48.52±6.18）岁。纳入标准：①HbeAg 均为阳性并接受肝活检检查；②符合《病毒性肝炎防治方案》［6］中慢性乙型肝炎诊及《肝纤维化中西医结合诊疗指南》［7］肝纤维化诊断标准。排除标准：①感染甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒引起的肝功能异常；②合并内分泌、血液系统疾病及心、肾功能衰竭者；③合并肝癌、脂肪肝等其他类型肝脏疾病；④既往存在肝脏或胆切除术者；⑤哺乳期或妊娠妇女。依据肝脏硬度测量值（liver stillness measurement，LSM）［8］将患者分为轻度肝纤维化组43 例（LSM<9.7 kPa）、中度肝纤维化组78 例（9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa）、重度肝纤维化组59 例（LSM≥17.5 kPa）。

同时选取170 例同期于本院接受健康体检且结果正常者作为对照组，其中男性89 例，女81 例，年龄平均年龄（48.58±6.19）岁。CHB 组、对照组年龄及性别等基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2 检测方法

1.2.1 血清b⁃FGF、TGF⁃β1 检测

抽取所有研究对象空腹静脉血3 mL，离心（2 000 r/min，15 min）去除残余细胞成分，取上层血清置于-70℃待检。采用酶联免疫吸附法检测b⁃FGF、TGF⁃β1 水平，试剂盒北京北方生物技术研究所提供，操作步骤严格按说明书执行。

1.2.2 血microRNA⁃34a 检测

血清标本收集：清晨空腹抽取所有研究对象外周静脉血3 mL 于试管中，静置20 min 后离心（8 000 r/min，4℃，10 min）去除残余细胞成分，取上层血清转移至另一试管中，再次离心（1 300 r/min。4℃，10 min），最后取500 μL 血清转移至无RNA酶的EP 管中分装，放入-80℃冰箱保存。采用逆转录和实时荧光定量⁃PCR 法检测血microRNA⁃34a 水平。miScript II RT 逆转录试剂盒购自德国QIAGEN 公司，反应体系为：miScriptHispct（5x）4 μL，miScriptNucleics（10x）2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA 模板12 μL。逆转录条件：37℃60 min，95℃10 min。按照试剂盒进行qPCR 反应（miScript SYBR Green 试剂盒，德国QIAGEN 公司），反应体系10 μL；预加热95℃30 min；变性94℃15 s，退火55℃30 s，延伸70℃30 s，共40 个循环。Ct 值为反应孔的荧光信号达到设定阈值的循环数。采用U6 作为内参，血清中miRNA⁃34a 的相对表达量为为2⁃△Ct=CtmiRNA⁃34a⁃CtU6。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0 统计学软件进行分析，计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，多组间行F检验；相关性采用Pearson 分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB 组与对照组血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较

CHB 组血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 CHB 组与对照组血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较（±s）Table 1 Comparison of serum levels of b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a between CHB group and control group（±s）

表1 CHB 组与对照组血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较（±s）Table 1 Comparison of serum levels of b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a between CHB group and control group（±s）

组别CHB 组对照t 值P 值n 180 170--b⁃FGF（pg/mL）36.90±10.25 13.08±3.52 28.740<0.001 TGF⁃β1（pg/mL）596.85±123.74 302.52±56.21 28.370<0.001 microRNA⁃34a 0.95±0.32 0.21±0.05 29.807<0.001

2.2 不同肝纤维化程度患者血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较

不同肝纤维化程度患者b⁃FGF、TGF⁃β1、mi⁃croRNA⁃34a 水平比较：轻度纤维化组<中度纤维化组<重度纤维化组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 不同肝纤维化程度患者血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a in patients with different degrees of liver fibrosis（±s）

表2 不同肝纤维化程度患者血清b⁃FGF、TGF⁃β1、microRNA⁃34a 水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a in patients with different degrees of liver fibrosis（±s）

注：与轻度肝纤维化组比较，aP<0.05；与中度肝纤维化组比较，bP<0.05。

组别轻度肝纤维化组中度肝纤维化组重度肝纤维化组F 值P 值n 43 78 59--b⁃FGF（pg/mL）25.81±9.68 34.78±9.75a 43.56±8.51ab 45.30<0.001 TGF⁃β1（pg/mL）497.36±117.52 558.39±119.80a 632.50±85.72ab 19.58<0.001 microRNA⁃34a 0.63±0.29 0.84±0.25a 1.12±0.16ab 55.91<0.001

2.3 CHB 患者b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a水平与肝纤维化程度的相关性分析

CHB 患者b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a 水平与LSM 呈正相关（P<0.05）。见表3、图1。

表3 CHB 患者b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a 水平与LSM 的相关性Table 3 Correlation between the levels of b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a and LSM in CHB patients

图1 CHB 患者b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a 水平与肝纤维化程度的相关性分析散点图Figure 1 Scatter diagram of correlation analysis between b⁃FGF，TGF⁃β1 and microRNA⁃34a levels and liver fibrosis in CHB patients

3 讨论

CHB 的危害性在于其可发展成为严重的肝脏疾病及产生相关并发症，导致慢性乙肝患者的高死亡率［9］。因此，诊断慢性乙肝患者肝纤维化的存在、鉴别肝纤维化的程度，从而实施合适的治疗方法控制或逆转肝纤维化是至关重要的。

肝穿刺活组织检查是从组织病理学的角度诊断肝脏病变，评估疾病预后，以及辅助判断临床治疗决策的可行性及为调整治疗方案提供指导的一种参考方法［10］。然而，肝穿刺活组织作为有创侵入性检查，实施的风险性较高；同时由于取样量的限制，在评估肝纤维化程度时缺乏一定的准确性。由于肝纤维化作为一个极其复杂的动态应急反应，是多种细胞、多种因素相互促进和制约的结果，因此一些血清生物化学指标逐渐成为临床监测手段，并引起广泛关注。

b⁃FGF 是是成纤维细胞生长因子家族成员之一，主要在调控细胞分化、增殖中发挥作用，肝窦内皮细胞、成肌纤维样细胞、血管内皮及平滑肌细胞和肝细胞是bFGF 分泌的主要场所［11］。b⁃FGF 在正常肝脏的表达对维持肝脏生理功能具有重要作用，主要包括维持血管活性、促进组织损伤修复及激活内皮细胞等。研究发现，在肝脏疾病的早期阶段，由于肝组织发生微循环障碍导致b⁃FGF 合成增加，刺激内皮细胞增生、迁移及分化，促使新血管形成［12］。而在肝病的中后期，b⁃FGF 在肝血管间隔及肝窦壁表达逐渐增强，一方面可减少细胞外基质降解所必需的酶，另一方面则抑制蛋白酶活性物质，从而导致细胞外基质堆积，影响机体的反应性［13］。从本研究中可以看出，随着肝纤维化程度的不断加重，b⁃FGF 水平呈上升趋势，且CHB患者b⁃FGF 水平与LSM 呈正相关关系，有力地佐证了血清b⁃FGF 的高表达可加快CHB 病程，通过监测b⁃FGF 水平变化可评估肝纤维化程度，为临床治疗提供思路。

在肝脏中，TGF⁃β 主要由非实质细胞合成，如肌成纤维细胞等。TGF⁃β1 可刺激肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，从而增加细胞外基质的合成，并且TGF⁃β1 使肝星状细胞活化后肝星状细胞又可分泌大量的TGF⁃β1，造成肝纤维化持续发展；同时TGF⁃β1 还可上调Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原表达，并降低基质金属蛋白酶合成及抑制促进纤溶酶原激活物的表达，降低细胞外基质的降解，从而加速纤维化发生发展。本研究结果进一步证实TGF⁃β1 是一种在肝纤维化发生、发展中具有重要作用细胞因子。此外，既往文献显示，肝炎病毒可通过免疫病理损伤直接或间接引起Kupffer细胞的大量激活、浸润，进而增加TGF⁃β1 的分泌［14］。而大量的TGF⁃β1 又可刺激贮脂细胞和其他间质细胞分泌TGF⁃β1，从而形成恶性循环。本研究发现CHB 患者TGF⁃β1 水平与肝纤维化程度呈正相关关系，故对CHB 患者TGF⁃β1 水平进行监测有助于早期肝纤维化的诊断及肝纤维化程度的判断。

信号通路参与肝星状细胞凋亡，高表达的miR⁃27a 和miR⁃27b 则可参与肝星状细胞活化并与肝脏中脂质代谢相关［15］。动物实验显示，在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中，miR⁃34a 消融处理的小鼠比野生型小鼠的肺纤维化更严重［16］。本研究发现microRNA⁃34a 水平与肝纤维化程度呈正相关关系，进一步提示血浆miR⁃34a 可作为鉴别慢性乙肝患者不同肝纤维化阶段的新候选标志物。

综上所述，b⁃FGF、TGF⁃β1 及microRNA⁃34a表达与CHB 纤维化程度呈现显著相关性，联合检测三者表达情况对CHB 病情和纤维化具有一定的诊断价值。