液相色谱⁃串联质谱法测定25⁃羟基维生素D

潘晓芳 黄燕虹 黄浩然 李海明 陈建起 吴静标★

作者单位：1.广东省医疗器械质量监督检验所综合检验四室，广东，广州510663

2.广州市丰华生物工程有限公司，广东，广州510730

维生素D（vita min D，VD）是人体必需的一类脂溶性类固醇衍生物。体内VD 经两次羟基化，形成具有生物活性的维生素代谢物（1，25⁃二羟基维生素D2，1，25⁃二羟基维生素D3等），其家族中最重要的成员就是25⁃羟基维生素D2（25⁃hydroxyvita min D2，25⁃OH VD2）和25⁃羟基维生素D3（25⁃hy⁃droxyvita min D3，25⁃OH VD3）［1］。《维生素D 及其类似物临床应用共识》指出：血清25⁃OH VD 水平检测已被公认为反映维生素D 状态的最合理指标［2］。LC⁃MS/MS 法能够有效区分25⁃OH VD2 和25⁃OH VD3，比免疫法灵敏度更高，是临床检测维生素D 的金标准［2⁃3］。因此，本研究建立了同时准确快捷测定血清中25⁃羟基维生素D2及25⁃羟基维生素D3的LC⁃MS/MS 法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

采用三重四极杆质谱分析系统（FH⁃6000MD，广州市丰华生物工程有限公司）；色谱柱（Accu⁃core aQ 2.1×50 mm，2.6 μm，Thermo Fisher Scientif⁃ic 公司）；多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；氮气发生器（Peak Scientific 公司）。

1.1.2 主要试剂

25⁃羟基维生素D 测定试剂盒（液相色谱⁃串联质谱法）（广州市丰华生物工程有限公司，批号：20190408）；甲醇：色谱纯，含量≥99.9%（Thermo Fisher 公司）；实验用水为Synergy 超纯水，电阻率不低于18 MΩ·cm⁃1。

1.2 实验参数

1.2.1 质谱参数

色谱柱为Accucore aQ C18 色谱柱（2.1×50 mm，2.6 μm）；柱温为40℃；流速为0.5 mL/min；进样量为10 μL；流动相A 为超纯水（含0.1%甲酸），流动相B 为甲醇（含0.1%甲酸）。采用梯度洗脱：0.0～1.0 min 70%B，1.0～2.0 min 75%B，2.0～2.1 min 98%B，2.1～2.6 min 100%B，2.6～3.5 min 100%B，3.5～3.6 min 70%B，3.6～5.0 min 70%B。质谱参数：离子源为电喷雾离子源（ESI）；离子模式为正极；喷雾电压为3 500 V；离子传输管温度为300℃；喷雾温度为400℃；鞘气流速为50；辅助气流速为12；吹扫气流速为0；Q1、Q3 分辨率（半峰宽）为0.7；质谱选择反应监测（SRM）参数见表1。

1.2.2 液相色谱参数

柱温：40℃；进样量：10 μL；流动相：A⁃超纯水（含0.1%甲酸），B⁃纯甲醇（含0.1%甲酸）。液相梯度见表2。

1.3 试液配制

1.3.1 同位素内标工作液的配制

取1.04 mg 25⁃OH VD2⁃d3 和1.05 mg 25⁃OH VD3⁃d3 标准品，用无水乙醇溶解，分别配成1 000 μg/mL 的25⁃OH VD2⁃d3 和25⁃OH VD3⁃d3 同位素内标准品储备液，再稀释配制成2.5 μg/mL和5.0 μg/mL的25⁃OH VD2⁃d3和25⁃OH VD3⁃d3同位素内标准品。

1.3.2 工作标准液的配制

取1.01 mg 25⁃OH VD2和1.01 mg 25⁃OH VD3标准品，用无水乙醇溶解，分别配成1 000 μg/mL的25⁃OH VD2和25⁃OH VD3标准品储备液。

将两种标准品储备液，以BSA 磷酸盐缓冲水溶液为溶剂，采用逐级稀释法，配成6 个25⁃OH VD2和25⁃OH VD3标准品混合液，得到1.99、3.98、9.95、19.90、39.80、99.50 ng/mL 的25⁃OH VD2工作标准溶液和4.98、10.95、29.85、59.70、104.48、248.75 ng/mL的25⁃OH VD3工作标准溶液。

1.3.3 25⁃OH VD 的待测样本的制备

①取待测样本200 μL 于相应的2 mL 离心管中，加入200 μL 的25⁃OH VD 同位素内标工作液，旋涡45 秒。②加入1 000 μL 的25⁃OH VD 萃取液，在2 000～2 400 rpm 振频下旋涡振荡10 分钟，于-20℃下静置10 分钟，13 000 rpm 离心5 分钟。③取最上层液体800 μL 转移到96 孔V 型底深孔板中，室温下氮气吹干。④加入200 μL 的25⁃OH VD 复溶液，盖好硅胶垫封板，在2 000～2 400 rpm振频下旋涡振荡3 分钟，进行复溶，置于96 孔板离心机中3 000～3 500 rpm 离心5 分钟。⑤放入自动进样器中，吸取上清液，进行样本检测、分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 对线性相关性、准确度相对偏差、重复性变异系数进行分析。

2 结果

2.1 保留时间和色谱分离验证

25⁃OH VD2、25⁃OH VD2⁃d3 和25⁃OH VD3、25⁃OH VD3⁃d3 对应色谱图见图1 和图2，分别在2.80、2.79 和2.76、2.76 min 出峰。

2.2 分析方法的线性关系验证

测试系列25⁃OH VD2和25⁃OH VD3工作标准溶液，将结果平均值和理论值用最小二乘法进行线性拟合，并计算线性相关系数（r），结果见图3。

2.3 准确度试验结果

分别检测25⁃OH VD2和25⁃OH VD3的高低两个样本，计算相对偏差，25⁃OH VD2高低两个样本的相对偏差分别为-5.62%～4.73%和-3.11%～1.48%，25⁃OH VD3高低两个样本的相对偏差分别为1.23%～7.91%和-4.09%～1.27%，见表3。

2.4 检测限试验结果

在H⁃ESI 正离子模式下，检测经过前处理浓度为2 ng/mL 的和25⁃OH VD2/D3时，最小信噪比SN为69，试验结果见表4。

2.5 重复性试验结果

用同一批试剂盒，以质控品的低值和高值为样本，每个测试样本重复检测10 次，计算变异系数，试验结果显示25⁃OH VD2/D3的变异系数CV 最大分别为3.67%和3.39%，见表5。

3 讨论

VD 对人体健康至关重要，理论上与VD 相关或潜在疾病均需要VD 的检测。维生素D 缺乏会引起骨骼系统、肌肉系统、心血管系统、免疫系统、神经系统、糖代谢、细胞增殖分化、内分泌系统、肿瘤等相关疾病。因此，定期检测VD 水平对疾病预防有重要意义［2］。

25⁃OH VD 常用的检测方法有液相色谱⁃串联质谱法和免疫法（包括化学发光分析法、酶联免疫法、克隆酶供体免疫测定法、免疫层析法、胶乳免疫比浊法）［4］。LC⁃MS/MS 法可以同时测定25⁃OH VD2和25⁃OH VD3，是临床检测25⁃OH VD 的“金标准”［2，3⁃6］。相对于免疫法，LC⁃MS/MS 法可以区分25⁃OH VD2和25⁃OH VD3，具有特异性强、灵敏度更高的特点，由于样品中掺入了同位素标记的25⁃OH VD2/D3，能够很好地消除基质效应［7］。检验医学溯源性联合委员会（The Joint Committee for Traceabil⁃ity in Laboratory Medicine，JCTLM）认可了NIST 和比利时根特大学建立的同位素LC⁃MS/MS 法定量测定血清中25⁃OH VD2、25⁃OH VD3的参考方法［8⁃10］。但是LC⁃MS/MS 法仪器昂贵，安装条件严格，需要较大场地方可满足要求；样本前处理复杂，检测通量比较低，比较难适应临床大批量样本的需求；手工操作比较复杂，操作人员需要经过比较专业的培训，难以推广；尽管被公认为检测25⁃OH VD 的金标准，LC⁃MS/MS 法仍然易受3⁃epi⁃25OH⁃D3和3⁃epi⁃25OH⁃D2等异构体的交叉影响，尤其对婴幼儿的检测易出现假阳性［11⁃13］。另外，由于色谱和质谱条件等未标准化，不同实验室之间的处理方法和色谱条件等不同，对同一个体也会产生不同的临床评价。

广州市丰华生物工程有限公司的25⁃羟基维生素D 测定试剂盒（液相色谱⁃串联质谱法）采用液液萃取法，操作简单快捷，样本前处理步骤简单、容易操作，沉淀蛋白和萃取一次完成，相比蛋白沉淀法基质效应更小，此方法简便快速，实现了对25OH⁃D2和25OH⁃D3的分别定量，适用于临床大样本量检测；其次试剂盒稳定性很好，可以满足2～8℃存放，随取随用；检测25⁃OH VD2和25⁃OH VD3有良好的线性关系，准确性高，重复性好的特点。25⁃OH VD 测定的其中一个问题是室间变异较大，各种免疫学方法之间的变异比较大，该试剂盒溯源至由美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）提供的SRM 968f，严格按照国家《医疗器械生产质量管理规范》进行质量管理体系建设，并获得ISO 9001 及ISO 13485 认证证书，试剂盒采用SRM 968f 验证了方法的准确性，结果显示25OH⁃D2和25OH⁃D3的准确度均在100%左右。综上，广州市丰华生物工程有限公司的25⁃羟基维生素D 测定试剂盒（液相色谱⁃串联质谱法）可以准确反映VD2和VD3情况，适用于儿童、孕妇、成年人、老年人的VD 水平检测，可以辅助临床指导上述人群有效合理地补充维生素，做到早发现、早干预、早治疗，对营养性疾病的降低有重大意义。

然而此次实验尚有不足，然而此次实验尚有不足，首先未通过比对或室间评价来验证体系的临床效果，其次是此方法仍然面临25⁃OH VD 与结合蛋白彻底分离的问题。