阿托伐他汀钙对COPD模型大鼠肺血管重塑的影响及机制探讨

2021-07-09何永鸿强丽王宋平

天津医药 2021年6期

何永鸿，强丽，王宋平△

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是由于接触、吸入有害有毒颗粒或气体导致气道和（或）肺泡异常，出现不可逆性气流受限。据世界卫生组织（WHO）统计，2020年COPD已居全球疾病的经济负担第5位［1］。气道、肺实质和肺血管炎症反应是COPD的主要特征，炎症反应和慢性缺氧进一步恶化会导致气道和肺血管重塑、肺实质破坏，最终进展为肺动脉高压，这是COPD病情不断进展，最终引起呼吸衰竭和肺源性心脏病的主要原因［2］。他汀类药物是临床上常用的调脂药物，目前主要用于心血管疾病的预防和治疗，但除了降脂作用外，他汀类还有抗炎、抗氧化、改善内皮功能、调节免疫等作用［3-4］。研究发现，他汀类药物有助于改善COPD患者的临床症状，延缓病情恶化，降低病死率［5-7］。目前关于他汀类药物抗炎作用的基础实验研究缺乏，他汀类改善COPD患者气道炎症、肺血管炎症及肺血管重构等相关机制尚不明确。本研究旨在观察阿托伐他汀钙通过组蛋白脱乙酰酶-2（HDAC2）对COPD大鼠肺血管炎症、肺血管重构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取健康雌性SPF级SD大鼠18只，7～10周龄，体质量（180±20）g，购自西南医科大学城北校区实验动物中心，并于西南医科大学忠山校区动物房进行饲养，环境温度24～26℃，湿度50%，每日给予足量食物及饮水。

1.2 主要试剂与器材阿托伐他汀钙片（立普妥，辉瑞制药有限公司，20 mg，国药准字H20051408）；脂多糖（Sigma公司）；中国娇子牌香烟（焦油量11 mg，烟气烟碱量1.1 mg，烟气一氧化碳量12 mg，四川中烟工业有限责任公司）；大鼠HDAC2酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（ELK Biotechnology公司）；Western blot试剂盒（武汉恒意赛生物技术公司）；兔抗大鼠HDAC2单克隆抗体、兔抗大鼠血管内皮生长因子（VEGF）多克隆抗体、内参GAPDH抗体及羊抗兔二抗（Aspen公司）；RNA提取试剂盒、逆转录及实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（ELK Biotechnology公司）；苏木素染液、伊红染液（国药集团化学试剂有限公司）；维多利亚蓝、苦味酸-酸性品红（VG）染液（Aspen）；PCR仪（基因扩增仪TCXP，杭州博日科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验大鼠模型的建立大鼠于动物房适应性喂养1周后，按照随机数字表法将18只大鼠分为空白对照组、COPD组、阿托伐他汀钙组，每组6只。空白对照组大鼠予以正常饲养，COPD组和阿托伐他汀钙组参照文献［8-9］建立COPD大鼠模型。实验周期共42 d，在第1、14天，大鼠经气道滴入脂多糖200μg，2～13 d、15～42 d予以香烟烟雾吸入，2次/d（间隔6 h），每次10支。阿托伐他汀钙组在COPD组的基础上，于第2天开始，每天烟雾吸入前30 min用阿托伐他汀钙片灌胃治疗，剂量10 mg/（kg·d）［10-11］，空白对照组、COPD组同期给予等量生理盐水灌胃。

1.3.2 体质量记录每组大鼠每日在相同环境下自由进食，3组大鼠共饲养6周，每2周称1次大鼠体质量，直至取材。

1.3.3 标本采集及制备（1）血清采集。第43天所有大鼠使用3%戊巴比妥钠注射液（1.5 mL/kg）进行充分麻醉，开胸后心脏取血，以3 000 r/min离心15 min后，取上层血清于-80℃冰箱保存。（2）病理标本制备。取大鼠新鲜右肺中叶组织，一部分保存于-80℃冰箱用于基因及蛋白表达测定，另一部分用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，切片（4μm）用于HE染色及维多利亚蓝+VG染色。

1.3.4 HE染色及维多利亚蓝+VG染色观察肺组织病理改变 HE染色：肺组织切片经乙醇和二甲苯脱水、蒸馏水冲洗后，加入苏木素染3～8 min，再经伊红染液染色1～3 min，再次脱水封片。维多利亚蓝染色+VG染色：切片经乙醇和二甲苯脱水，使用维多利亚蓝染色0.5～2 h，使用无水乙醇分化后，苦味品红溶液中染5 min后脱水封片。HE染色后光镜下观察病理改变并评价肺血管炎症程度。炎症评分标准：无炎性细胞浸润（0分）；少许炎性细胞浸润（1分）；炎性细胞浸润较多但分布不均匀（2分）；炎性细胞浸润多，分布均匀，但不聚集成团（3分）；大量炎性细胞浸润并聚集成团（4分）。维多利亚蓝+VG染色后，利用图像分析软件测定肺血管重构指标：400倍高倍镜下选择50～100μm的肌性动脉（MA）进行图像分析，计算血管壁面积/血管总面积（WA%）、血管壁厚度/血管外径长度（WT%）。

1.3.5 ELISA检测血清HDAC2水平采用双抗原夹心法，加入标准品或待测样品100μL，37℃孵育2 h，加入生物素化抗大鼠HDAC2抗体稀释剂100μL，37℃反应1 h，PBS洗涤3次，每孔加生物素HRP工作液100μL，37℃温育25 min，上述步骤反复5次，每孔加入90μL TMB底物显色液，37℃避光孵育20 min，最后每孔加停止液50μL，在酶标仪450 nm波长处测量各孔的光密度（OD）值，并根据标准曲线计算HDAC2水平。

1.3.6 Western blot检测肺组织HDAC2和VEGF蛋白表达水平取左肺组织100 mg，PBS充分清洗后提取蛋白，BCA法测定样品蛋白浓度。每孔40μg行SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V、分离胶120 V），300 mA恒流转膜后将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h。弃去封闭液，分别加入兔抗大鼠一抗HDAC2（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4℃孵育过夜，回收稀释的一抗，TBST洗涤3次，每次5 min，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1∶3 000），室温孵育30 min，TBST洗涤4次，每次5 min。滴加新鲜配制的ECL发光液，于暗室曝光、显影、定影。

1.3.7 qPCR检测肺组织HDAC2mRNA表达取新鲜左肺上叶组织，提取总RNA后将RNA逆转录为cDNA，并进行qPCR扩增目的基因。引物序列见表1。qPCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次。采用2-ΔΔCt法计算HDAC2相对表达量。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 统计学方法使用SPSS 19.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q法，两变量间相关性使用Pearson法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及体质量变化经适应性喂养1周后各组大鼠一般情况良好，进食摄水正常，毛发颜色明亮光泽。分组干预2周后，空白对照组、阿托伐他汀钙组大鼠一般情况良好，无特殊改变，COPD组大鼠出现间断喘息、咳嗽，呼吸急促。干预6周后，空白对照组无明显改变，食欲正常，精神状态良好；COPD组大鼠进食减少，精神状态欠佳，毛发变黄、脱落，伴明显呼吸急促、喘息、呼吸困难；阿托伐他汀钙组大鼠间断咳嗽，无明显呼吸急促等症状，毛发稍变黄，精神状态良好。实验初期各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05），在第2、4、6周时，与空白对照组相比，COPD组大鼠体质量下降（P＜0.05）；与COPD组相比，阿托伐他汀钙组大鼠体质量明显增加（P＜0.05），见表2。

2.2 各组肺组织病理改变

2.2.1 HE染色空白对照组可见肺血管及气道周围组织形态正常，炎性细胞较少，炎症评分降低。COPD组气管壁明显增厚，肺组织、气管及血管周围有大量炎性细胞聚集，肺血管平滑肌增生明显，肺间隔明显增厚，炎症评分较空白对照组升高。阿托伐他汀钙组肺气管壁以及肺气管周围炎性细胞浸润较COPD组有较大改善，肺血管平滑肌增生程度低于COPD组，炎性细胞减少，但较COPD组炎症评分降低。见图1、2，表3。

Tab.2 Changes of body weights in different time points of the three groups of rats表2 3组大鼠各时期体质量的变化（n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与COPD组比较，P＜0.05

2.2.2 维多利亚蓝+VG染色空白对照组大鼠动脉血管壁正常；COPD组动脉血管周围出现完整弹力板，动脉肌性化改变明显；阿托伐他汀钙组动脉血管壁增生较COPD组明显减轻，未出现完整内外弹力板。与空白对照组比较，COPD组、阿托伐他汀钙组大鼠肺血管WA%、WT%明显增加，与COPD组相比，阿托伐他汀钙组肺血管重构程度减轻，WA%、WT%下降（P＜0.05），见图3、表3。

Tab.3 Changes of pulmonary vascular remodeling indicators in the three groups表3 各组大鼠肺血管重塑指标的改变（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与COPD组比较，P＜0.05

2.3 3组大鼠血清HDAC2含量比较 ELISA结果显示，与空白对照组比较，COPD组大鼠血清HDAC2含量明显降低（P＜0.05）；与COPD组比较，阿托伐他汀钙组血清HDAC2含量升高（P＜0.05）。见表4。

2.4 3组大鼠肺组织中HDAC2、VEGF表达水平比较与空白对照组比较，COPD组肺组织中HDAC2 mRNA和蛋白表达水平下降，VEGF蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与COPD组比较，阿托伐他汀钙组大鼠肺组织HDAC2 mRNA和蛋白表达升高（P＜0.05），VEGF表达降低（P＜0.05）。见图4、表4。

Tab.4 Comparison of HDAC2 and VEGF expression levels in serum and lung tissues of rats between the three groups表4 3组大鼠血清和肺组织中HDAC2及VEGF表达水平比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与空白对照组比较，b与COPD组比较，P＜0.05

Fig.4 Expressions of HDAC2 and VEGF in lung tissues of the three groups图4各组肺组织中HDAC2、VEGF的表达

3 讨论

COPD是临床常见的呼吸系统内科疾病，以小气道炎症为基础病理改变［12］。目前认为COPD患者气道炎症由炎症相关基因过表达导致，其表达由组蛋白乙酰化酶（HAT）和脱乙酰化酶（HDAC）共同调节［13-14］。HDAC可通过逆转核心组蛋白表达来抑制炎症相关基因的表达，而HDAC2作为HDAC家族的主要成员，是COPD发病涉及的主要亚型。在COPD进展时，外周血及肺组织中HDAC2表达逐渐减少，导致染色质辅助因子无法辅助染色质的致密卷曲、转录，激活转录因子RORγt无法完成乙酰化，竞争性增加核因子（NF）-κB乙酰化，产生大量白细胞介素（IL）-8、IL-17、肿瘤坏死因子（TNF）-α等炎性因子和VEGF、内皮素-1（ET-1）等血管内皮因子，导致气道、肺实质、肺血管的炎症反应，促使肺血管内皮功能紊乱，肺血管收缩、舒张功能受损，形成肺血管重塑［15-16］。

阿托伐他汀钙是常用的调脂药物，主要通过抑制脂质合成中的经甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCoA）还原酶的合成，使得甲羟戊酸和胆固醇合成减少。除了降血脂以外，阿托伐他汀可减轻COPD患者气道炎症、减少气道黏性分泌物，缓解气道高反应性，改善COPD患者肺功能［17］。He等［18］证实阿托伐他汀可以抑制肺组织炎症进一步加重，其机制可能与减少甲羟戊酸和胆固醇合成，同时减少了三羧酸循环中三磷酸鸟苷结合蛋白（GTP）生成，遏制了炎性因子C反应蛋白（CRP）的释放有关［19］。在本研究中，与COPD组大鼠比较，阿托伐他汀钙组肺血管周围炎性细胞聚集减少，血管内皮损伤、肺血管炎症减轻，WA%、WT%等肺血管重塑指标下降明显，VEGF表达减少，提示阿托伐他汀可以改善肺血管炎症及肺血管重塑水平。本研究还发现，COPD状态下大鼠体内HDAC2水平降低，经阿托伐他汀干预后HDAC2水平增加，支气管炎症明显减轻，这与付晓等［20］和Lai等［21］的研究结果一致。结合本实验结果及文献报道，推测阿托伐他汀在抑制HMG-CoA还原酶生成的同时，减少GTP含量，抑制NF-κB乙酰化，反馈调节提高HDAC2的表达［22］，由于NF-κB乙酰化减少，各种炎性因子释放减少［23］，使得肺动脉血管炎症明显减轻。此外阿托伐他汀还能改善血管内皮细胞功能，维持血管通透性和舒缩功能，进一步稳定肺血管内环境。另外，本实验发现阿托伐他汀可以抑制肺组织中VEGF因子的表达，证实阿托伐他汀可以通过抑制VEGF阻止肺血管病理性增生，改善肺血管重构程度，但其机制是阿托伐他汀促使HDAC2含量增加间接减少VEGF的产生有关，还是阿托伐他汀直接作用血管内皮细胞抑制VEGF释放，尚不明确，需进一步探讨。

综上所述，阿托伐他汀可以一定程度上改善COPD肺血管炎症及肺血管重塑，其机制可能是通过提高HDAC2的表达水平，抑制炎症相关基因表达，减少炎性因子、肺血管内皮因子的释放。