稻城县牦牛布病抗体检测与分析

唐 川，陈和强

(甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000)

0 引言

布鲁菌病(brucellosis)是一种由布鲁氏杆菌引起的多种动物的慢性传染病，也可以感染人，又称布鲁氏杆菌病。在家畜中牛、羊、猪易感。主要表现为动物流产、死胎、不孕，引起子宫、胎盘、睾丸发炎等病理变化，不仅危害畜牧产业的发展而且威胁着人类健康。属于我国二类动物疫病，该病最主要的传染源是感染的妊娠母畜，其流产时排出的阴道分泌物、胎衣和胎儿中都带有大量细菌。幼龄动物对布鲁氏菌不易感，性成熟后对该该病的易感性增高。流产主要发生在初次妊娠的动物身上，患病动物往往只发生一次流产，再次流产的少见。本病主要通过消化道传播，其他的传播途径有呼吸道，皮肤等。布鲁氏菌病的流行常常是由于饲养管理不良、营养不足、潮湿及养殖密度过大等原因造成。人类多数为职业感染，兽医、饲养管理人员、屠宰场及动物加工厂工人在接触流产动物时易发生感染。人感染后体温异常，波浪热或长期低热，关节肌肉疼痛，睾丸炎附睾炎，流产及生殖障碍。因此本病不仅阻碍了畜牧业的发展，而且严重威胁着公共生物安全。

在四川省，布鲁氏杆菌病是重点防控的主要人兽共患疾病，四川省动物疾病预防控制中心考察研讨四川省布鲁氏菌病的流行状况和防治效果发现，该病在20世纪末通过采取以免疫为主，免、检、杀、灭的综合防治措施使疫情得到有效控制，然而近年来布鲁氏菌病的流行有回升的趋势。2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划，鼓励有条件的省份开展布病感染情况调查，分析疾病的流行情况，以便制定合理的疾病防控计划。在稻城县，牦牛养殖是当地人民的重要经济支柱，但由于该地区环境复杂，养殖粗放和兽医技术落后，布病的检测存在较大难度，四川省甘孜州稻城县牦牛布病的感染状况还未见完整的报道。

布鲁氏菌病的确诊须进行实验室检查，诊断和检疫布病的最常用方法是凝集试验，其优点是特异强和敏感高。我国最常用的检测试验为虎红平板试验和试管凝集试验，其中虎红平板试验是OIE确定的国际贸易指定试验，本研究通过用虎红平板试验初筛，阳性和可疑者用试管凝集试验复核方法对稻城县牦牛布病抗体进行检测与分析，从而为稻城县牦牛布病的防治提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验场地

甘孜州动物疫病预防控制中心实验室。

1.2 试验材料

1.2.1 被检血清

2018年由稻城县农牧科技供销合作局，在稻城县不同乡镇的牧户中采集并分离牦牛血清，共采集200份。

1.2.2 主要试剂

商品化的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌病凝集抗原、阴性血清、阳性血清、苯酚(石炭酸)、0.9%生理盐水。

1.3 方法

首先对牦牛血清用虎红平板凝集试验进行初次检验，检测结果为阳性和可疑血清用试管凝集试验再次检验，试管凝集试验阳性即为布鲁氏杆菌病感染。

1.3.1 实验室检测生物安全防护

实验人员开始实验前，脱掉外衣及鞋子，穿戴好实验服、防护服、一次性口罩及帽子。实验前后都要对实验室进行全面消毒灭菌，进行虎红平板凝集试验时选用一次性专业检测纸板，进行试管凝集试验时选用一次性试管，使用后直接废弃以减少污染。试验结束后，将使用过的一次性试验用品和防护用品，消毒后焚烧或无害化处理。工作人员脱掉防护用品后，用0.5%新洁尔灭浸泡双手，再用肥皂水冲洗。在更衣室脱下实验服并用紫外光照射消毒。

1.3.2 虎红平板试验

按照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准布氏杆菌平板凝集试验操作规程》进行。

1)将受检血清、布鲁氏菌标准阴、阳性血清和抗原从冰箱取出平衡至室温，涡旋混匀血清和抗原，吸取30 μL的被检血清在玻璃板4 cm2方格内的一侧，再吸取虎红平板凝集抗原加于玻璃板方格的另一侧。

2)用灭菌的移液器吸头快速搅拌混合抗原和血清，混匀成直径约2 cm的圆形。反应4 min后可观察结果。

3)同时设置标准阴性血清和阳性血清对照。

结果判定:在标准阴性血清不出现凝集、标准阳性血清出现凝集时，试验成立，待测血清在4 min后若出现肉眼可见凝集现象则认为是阳性，不出现凝集认为是阴性。

1.3.3 试管凝集试验

1)试验开始前先将待测血清、抗原液等取出冰箱，放置于室温条件下，待其恢复到室温后开始试验，试验应在18℃～25℃条件下进行。

2)使用前应当混匀试剂。

3)稀释液。0.5%苯酚(石炭酸)生理盐水：将5 mL苯酚加入1 000 mL生理盐水中；配制0.9% 生理盐水：称取NaCl，9 g定容到1 000 mL。

4)稀释抗原液：用配置好的稀释液来稀释布鲁氏菌病凝集抗原，稀释的比例为1：10。

5)准备3只试验管，1只试管中加入2.4 mL生理盐水，另2只试管各加入0.5 mL生理盐水。

6)取待测血清0.1 mL加入2.4 mL生理盐水内，混匀后取0.5 mL加入第2试管做倍比稀释，混合后取0.5 mL加入第3试管做倍比稀释，第1管应当弃去1.5 mL剩余0.5 mL稀释血清，最后一管弃去0.5 mL剩余0.5 mL稀释血清。

7)将0.5 mL稀释抗原液分别加入上述不同稀释倍数的血清中，各管内待检血清分别稀释为1：25、1：50、1：100。

8)阴阳对照试验管制备：将阴阳对照血清按要求体积稀释后，操作步骤参照5)、6)、7)。

9)比浊管制备：将已稀释好的工作抗原用等量稀释液作对倍稀释，然后按表1配制比浊管。

表1 试管凝集试验参照比浊管的配置

10)孵育：将试验管，对照管及比浊管充分振荡后置37℃±l℃温箱中孵育20～22 h，取出室温静置2 h，不需摇晃，以比浊管为标准判定结果。

结果判定：待检血清效价在1:100(++)及以上者为阳性。

2 结果

稻城县牦牛血清布病检测共200份，总阳性率为3%。其中3个不同乡镇的牦牛血清样本有2个乡镇检测出阳性样品，赤土乡检测出5个阳性样品，阳性率3.55%；傍河乡1个阳性样品，阳性率3.57%；香格里拉乡0个阳性样本，阳性率0%。血清检测结果如表2所示，虎红平板凝集试验结果如图1所示，试管凝集试验结果如图2所示。

表2 稻城县牦牛布病抗体检测结果

图1 虎红平板凝集试验结果

图2 试管凝集试验结果

3 结论

基于对稻城县牦牛布病抗体进行检测与分析，发现稻城县部分地区牦牛存在布鲁氏菌的感染。为了有效控制稻城县牦牛布鲁氏病的流行，有关部门应当引起高度重视，出台相应的防治政策。

4 讨论

4.1 稻城县牦牛布病感染情况分析

布鲁氏菌病是导致牦牛繁殖障碍的重要原因，往往给牦牛养殖业造成重大经济损失，同时作为人兽共患病，也严重危害着公共卫生安全。牦牛布病感染各地均有报道，林元青[1]等2015年检测采集于青海省不同地区的牦牛血清样本，结果显示阳性率高达39.29%；黎能金[2]等2008年对四川阿坝州牦牛检测表明，布病的感染率为5%；余朝彦[3]等2012年对四川阿坝地区牛检测表明，布病的阳性率为5.23%。通过检测稻城县牦牛血清布病阳性率发现，稻城县存在布鲁氏菌的感染，病畜长期带菌排菌，牦牛在混饲的情况下极易造成传染。为有效控制稻城县牦牛布鲁氏病的流行，有关部门应当高度重视，出台相应的防治政策。

4.2 出现布病疫情的原因

4.2.1 传染源没有彻底清除

该地区牦牛出现流产症状后，经诊断检疫确诊为布鲁氏菌病，由于病畜扑杀经费有限，对阳性畜处理不彻底，虽采取了阳性畜隔离，对其圈舍进行消毒等措施处理，但措施不严密，使其成为新的传染源，导致更多的牲畜感染。

4.2.2 外源疫病的传入

随着畜牧业的发展，自繁自养已满足不了养殖户的生产需求，外引动物成为必然趋势，外引动物没经过严格检疫就混群饲养，导致更多的牲畜出现感染[4]。

4.2.3 饲养者饲养管理水平参差不齐

调查数据显示，稻城县布鲁氏菌病阳性病例主要集中出现在个别畜主饲养的牦牛群中，这表明牦牛布鲁氏菌病的感染与饲养管理情况密切相关。有的畜主给牦牛饲喂受污染的饲料或饲料营养不均衡，导致牦牛群免疫力下降，更易受到布鲁氏菌病的感染。此外环境的卫生也是重要环节，未做到定期消毒，发生疫情后未彻底消毒也会导致布病的感染[5]。

4.3 措施与建议

未发病地区注意饲料卫生，保证饲料合理的营养配比，搞好环境卫生，定期消毒。坚持自繁自养，如需引种须经过免疫学检查，确保健康无病方可混群。发病地区，通过全群检疫，淘汰阳性动物，来净化畜群。通过人工授精，产仔后立即隔离，产房消毒等方法繁殖健康幼畜。同时对污染的环境进行严格消毒。控制人员流动，设立消毒通道，人员、车辆消毒后方可进出养殖场。

做好免疫接种工作，布鲁氏杆菌是兼性胞内寄生菌，对化学药物抵抗力较强，免疫接种是控制本病的有效措施。可采用牛流产布鲁氏菌19号苗对易感畜群进行免疫接种，采取连续3年免疫、第4年停免、第5年最后一次免疫的防控程序。接种防疫期间，注意做好血清抗体监测，阳性保护率在80%以上，才能达到保护的最终目的[6]。

人布病的预防要注意职业感染，加强宣传教育，养殖场工人、兽医、屠宰场及动物加工厂人员在接触患病动物和阳性动物时要注意防护，特别是在产仔季节。相关人员定期体检，疑似布鲁氏菌病的要及时诊断，及时治疗，避免转变为慢性[7]。