种用鸡群不同样本与品种的禽白血病ELISA检测分析

许国洋，付文贵，徐登峰，周 雪通信作者

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460)

0 引言

禽白血病(Avian Leukosis)是由反转录病毒科，甲型反转录病毒属的禽白血病、肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，可感染所有种禽群和商品鸡群[1-2]。该病毒为反转录病毒科，病毒粒子呈20面体对称，有囊膜，病毒抵抗力较差，对高温、强碱和强酸较为敏感。依据禽白血病病毒的宿主范围和抗原性可将其分为多个亚型，其中，鸡外源性禽白血病病毒主要包括A、B、C、D和J亚群，以及内源性的E亚群[3]。鸡群感染禽白血病后，易出现免疫力下降、肿瘤性疾病、产蛋率降低等症状，严重者引起死亡，对家禽业发展造成严重威胁[4-5]。该病尚无有效疫苗和特效药物，主要防控措施是加强疫病监测，淘汰阳性病例，切断垂直传播途径，优化种用鸡群，加强饲养管理。目前，重庆地区偶有禽白血病的发生，基于此，针对重庆武隆某养鸡场开展种用鸡群的禽白血病检测，为该场疫病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

武隆区某种鸡场鸡群，包括武隆黑鸡、大宁河鸡、青脚麻鸡、石柱土鸡、凤羽鸡、罗曼粉+麻鸡杂交6个品种，6～7月龄。

1.2 主要试剂和仪器

DF-1细胞，由重庆市畜牧科学院实验室提供；IDEXX禽白血病p27抗原检测试剂盒，购自美国IDEXX公司；CO2培养箱，购自艾利特生物科学(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的处理

泄殖腔拭子：采样前在样本管中加入1 mL样本稀释液，专用无菌棉签采集种鸡泄殖分泌物，置于样本管后-80℃保存备用。蛋清：收集种用母鸡新鲜鸡蛋，75%酒精棉球消毒鸡蛋和打孔器，打孔器在鸡壳上钻小孔，5 mL注射器吸取约1 mL蛋清至无菌样本管中，-80℃保存备用。精液：采集公鸡精液50 μL于1.5 mL离心管中，离心管中含150 μL灭菌的PBS溶液，混匀后，反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，取上清接种于DF-1细胞中，37℃，5% CO2培养箱中连续培养7 d，反复冻融3次，收集上清，-80℃保存备用。

1.3.2 不同样本的禽白血病抗原检测分析

随机选取100只母鸡和100只公鸡，采集2次泄殖腔拭子、鸡蛋和精液样本，时间间隔1 d。参照试剂盒说明书，吸取不同样本100 μL，加入到ELISA反应板中，并分别加入阴性对照和阳性对照100 μL各2孔，盖好反应板，在25℃条件下孵育60 min；350 μL蒸馏水洗板3次，最后一次洗板后将液体拍干；每孔加入100μL酶标抗体，在25℃条件下孵育60 min；重复洗板操作；每孔加入100 μL TMB底物，盖好板在25℃条件下避光孵育15 min后，每孔加入100 μL终止液终止反应；酶标仪测定650 nm吸光值，通过计算检测样本与阳对照比值(S/P)进行样本的阴、阳性判定。S/P>0.2判定为阳性，S/P≤0.2判定为阴性。同时，对比分析不同样本检测结果的重复性。

1.3.3 不同品种的的禽白血病抗原检测分析

依据不同样本的检测结果，选用合理的样本采集方式，针对该鸡场不同品种种用鸡群进行抗原检测，检测方法参照1.3.2，并对不同品种的禽白血病感染情况进行对比分析。

2 结果

2.1 公、母鸡不同样本ALV-p27抗原检测结果

ELISA检测100份鸡群泄殖腔拭子，23份样本为阳性，阳性率23%。对应的蛋清样本中，25份为阳性，阳性率25%。结果显示，蛋清ALV-p27抗原阳性检出率高于泄殖腔拭子。而公鸡的精液阳性率(26%)高于泄殖腔拭子的阳性率(24%)，如表1所示。

表1 不同样本ALV-p27抗原检测结果

2.2 不同样本检测结果的重复性分析

对各样本检测结果的重复性分析，发现母鸡泄殖腔试子和蛋清样本的重复率差别较小，分别为95%和96%；公鸡的泄殖腔试子和精液样本的重复率分别为96%和100%，精液的重复性高于泄殖腔试子，结果如图1所示。

图1 种鸡各样本检测结果重复性分析

2.3 不同品种的种鸡禽白血病ALV-p27抗原检测结果

基于各样本检测结果和样本处理的复杂程度，对于种群较大的鸡群选择泄殖腔拭子作为样本进行ELISA检测，共计检测母鸡2 322只，ALV-p27抗原阳性数量392只，阳性率16.88%。公鸡429只，p27抗原阳性数量129只，阳性率30.07%。不同品种种鸡ALV-p27抗原阳性率明显差异较大如表2、表3所示。

表2 不同品种母鸡泄殖腔拭子ALV-p27抗原结果

表3 不同品种公鸡群泄殖腔拭子ALV-p27抗原结果

3 讨论

通过对该鸡场禽白血病进行检测，发现该场存在禽白血病阳性病例，通过对种用鸡群不同样本的检测，发现泄殖腔试子、蛋清和精液均可获得较好的检测结果，其中，精液的检测结果重复性高于泄殖腔试子，但综合考虑检测时效性、准确性和重复性，泄殖腔拭子更适合种群的大规模检测，而蛋清和精液更适合少量样本的检测。此外，该种群中，青脚麻鸡的禽白血病检出率均远低于其他品种，其中母鸡阳性检出率为2.23%，公鸡为9.80%，该场地可加大青脚麻鸡的饲养量。结合其养殖品种、饲养模式和养殖规模，建议扩大检测规模，对各阶段鸡群进行抽样检测，及时淘汰阳性病例，重点对种鸡子代鸡群进行抗原检测，切断垂直传播途径，同时，加强饲养管理，对粪污及时处理，防止水平传播[6]。