清开灵注射液对急性脑缺血大鼠不规则趋化因子表达的影响

刘豫玥 闫杨杨 狄波 潘彦舒

摘要 目的：观察清开灵注射液对大鼠脑梗死缺血性损伤急性期阶段，不规则趋化因子（Fractalkine，FKN）的表达变化，探讨清开灵注射液治疗急性脑缺血的可能机制。方法：线栓法制备大鼠大脑中动脉永久性梗死模型（MCAO），随机分为假手术组、模型组，清开灵注射液观察组，TTC染色观察大鼠治疗前后脑组织梗死体积变化，同时采用蛋白芯片、ELISA和免疫组化法分别检测脑脊液、外周血清及脑组织中FKN的表达水平。结果：脑组织TTC染色顯示模型组均出现明显梗死灶，清开灵观察组的梗死体积明显缩减。与模型组比较，清开灵观察组明显下调病变局部脑组织的FKN（P<0.05），且能明显上调血清中的FKN（P<0.05），同时观察到其可上调脑脊液及全脑的FKN，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：清开灵注射液能缩小脑梗死体积，减轻急性脑缺血性损伤，其机制可能与调节FKN的表达有关。

关键词 急性脑缺血;不规则趋化因子;清开灵注射液;大鼠

Effect of Qingkailing Injection on the Expression of Irregular Chemokines in Rats with Acute Cerebral Ischemia

LIU Yuyue1，YAN Yangyang2，DI Bo3，PAN Yanshu4

（1 Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 Dongzhimen Hospital

Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100070，China; 3 China Academy of Chinese medical

Science，Beijing 100070，China; 4 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the expression changes of irregular chemokine （Fractalkine，FKN） in the acute phase of ischemic injury of rat cerebral infarction by Qingkailing Injection，and to explore the possible mechanism of Qingkailing Injection in the treatment of acute cerebral ischemia.Methods：A rat model of permanent middle cerebral artery infarction （MCAO） was prepared by suture method and randomly divided into a sham operation group，a model group，and a Qingkailing Injection treatment group.TTC staining was used to observe the changes in infarct volume of rat brain tissue before and after treatment.Protein chip，ELISA and immunohistochemistry were used to detect the expression level of FKN in cerebrospinal fluid，peripheral serum and brain tissue.Results：TTC staining of brain tissue showed that there were obvious infarcts in the model group，and the infarct volume in the Qingkailing treatment group was significantly reduced.Compared with the model group，the Qingkailing treatment group significantly down-regulated the FKN of the diseased local brain tissue （P<0.05），and significantly increased the FKN in the serum （P<0.05）.It was observed that it could up-regulate the cerebrospinal fluid and the whole brain FKN.But the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion：Qingkailing Injection can reduce the volume of cerebral infarction and reduce acute cerebral ischemic injury.The mechanism may be related to the regulation of FKN expression.

Keywords Acute cerebral ischemia; Fractalkine; Qingkailing Injection; Rat

中图分类号：R285.5;R743文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.014

急性脑缺血损伤可继发引起炎性反应及应答，产生的一系列炎性因子，其始动环节离不开一系列趋化因子的参与。不规则趋化因子（Fractalkine，FKN）是家族中较少的在中枢神经系统中组成性表达的趋化因子之一，近年来在急性脑缺血性损伤中的作用也逐渐受到关注。FKN主要集中分布在大脑皮质、海马、尾状壳核、丘脑、嗅球[1]，缺血再灌注损伤的脑海马中FKN信号显著增加，抑制CX3CR1受体功能，进一步激活更多的小胶质细胞及炎性反应因子表达水平，加重中枢神经炎性反应及认知损害[2]，而炎性反应的程度与急性脑缺血损伤程度密切相关。团队前期实验发现清开灵注射液能够升高脑缺血大鼠的行为学神经功能评分，减轻脑组织病理损伤[3]，但其分子机制目前尚不是十分清楚，本研究观察急性脑梗死引发的急性脑缺血损伤，检测FKN表达变化，探讨清开灵注射液治疗急性脑缺血的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SPF级8～9周龄Wistar大鼠，体质量（300±20）g，购于北京维通利华公司实验动物中心[SCXK（京）2007-0001]，质量合格证号：0243109。所有动物在北京中医药大学动物实验室饲养，饲养温度控制在22 ℃，相对湿度60%，12 h光/暗周期，自由饮水。

1.1.2 药物 清开灵注射液（北京中医药大学药厂，批号：913204A）购于北京中医药大学东直门医院，无菌生理盐水（泽叶生物有限公司，货号：ZY034）购于北京中医药大学东方医院。

1.1.3 试剂与仪器 FKN ELISA试剂盒[EBSBL（美国），货号：4431];FKN抗体[Bio Vision（美国），货号：5088-100];Super Polymer-二步法IHC试剂盒（北京康为世纪生物科技公司，批号：CW0177），DAB显色试剂盒（北京康为世纪生物科技，批号：CW0125）;大鼠细胞因子抗体芯片试剂盒[Ray Bio（美国），货号：AAR-CYT-119]，BCA蛋白质定量试剂盒（上海康成生物，批号：KTD3001）、磷酸缓冲液PBS（艾美捷科技有限公司，美国，货号：PBL07-6X500ML），低温离心机（Eppendorf公司，德国，型号：Centrifuge 5810 R）、光学显微镜（徕卡，德国，型号：DM1000）、组织切片机（徕卡，德国，型号：RM2235）、组织包埋机（徕卡，德国，型号：EG1150H+EG）、染色机（赛默飞，美国，型号：Gemini）、酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司，型号：MR-96A）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 健康雄性Wistar大鼠，共39只，平均分为假手术组、模型组、清開灵治疗组。参照Zea Longa等[4]报道的方法进行改良，建立大鼠左侧大脑半球永久性大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，Wistar大鼠采用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g体质量）腹腔注射进行麻醉，仰卧固定于手术板上，颈部偏左切开，逐层分离组织，暴露左侧颈总动脉（Common Carotid Artery，CCA）、颈外动脉（External Carotid Artery，ECA）、颈内动脉（Internal Carotid Artery，ICA），永久结扎CCA近心端、ECA根部，微动脉夹暂时夹闭CCA的远心端，在CCA结扎处远心端剪一斜口，经此斜口插入顶端光滑成球面的直径0.24 mm的尼龙线，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉（Anterior Cerebral Artery，ACA）的起始部，从而闭塞了大脑中动脉（Middle Cerebral Artery，MCA）的起始部，造成MCA供血相关区的梗死。尼龙线平均插入深度为（18.5±0.5）mm，结扎CCA远心端以固定尼龙线和防止出血，减去尼龙绳尾端，逐层缝合组织，模拟急性脑缺血梗死。术后6 h参照Longa神经症状评分，选总分高于4分者的大鼠进行正式实验。见表1。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 TTC法检测脑梗死体积 术后24 h，假手术组取10只，模型组及清开灵观察组各取13只大鼠新鲜大脑组织-20 ℃冰箱冷冻20 min后，冠状面均匀切5片，将切片避光放入1%TTC染液中30 min，梗死部位呈白色，假手术组脑组织呈红色。将切片依次摆好，拍照，采用Image-pro Plus 5.0软件计算梗死体积。

1.2.2.2 蛋白芯片法和酶联免疫法检测FKN的浓度 术后24 h，假手术组取10只，模型组及清开灵观察组各取13只抽取清亮脑脊液，混合，3 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，蛋白芯片试剂盒检测;腹主动脉取血5 mL，静置30 min，析出血清，3 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 min，取上清液，ELISA试剂盒检测;新鲜缺血侧大脑皮质，按重量体积比加冰冷生理盐水制备成10%的组织匀浆，3 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，ELISA试剂盒检测。

1.2.2.3 HE染色 各组动物术后24 h采用4%多聚甲醛经心脏灌流前固定，断头取脑后放入4%多聚甲醛中后固定24 h，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，行石蜡包埋，制成5 μm厚度的大脑同一冠状面石蜡切片，常规脱蜡至水，入Harris苏木精染色5 min，自来水冲洗，50%的盐酸乙醇分色30 s，水洗后酸化伊红复染10 min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察。

1.2.2.4 免疫组化法测定FKN表达 石蜡切片制备同前。1）PBS（pH=7.4）冲洗3 min×3次;2）热修复2 min;3）滴加3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶的活性;PBS冲洗3 min×3次;4）滴加稀释好的第一抗体（浓度均为1∶200），4 ℃过夜;5）PBS冲洗3 min×3次，除去PBS液;6）滴加即用型Super Polymer试剂，室温下孵育10～15 min，PBS冲洗3 min×3次;7）除去PBS液，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5 min;8）自来水冲洗终止显色反应，苏木素轻度复染，水洗泛蓝;9）梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。各组均设定一阴性对照组，PBS代替一抗，其余条件相同。

1.2.2.5 图像分析 每张切片的梗死缺血皮层区随机选取5个不重叠高倍视野，用显微镜图像采集系统采集图像，并用Image-pro Plus 5.0图像分析软件计数阳性细胞数，平均光密度来反映切片上缺血侧皮层区阳性染色细胞数目。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，数据经正态性及方差性检验采用单因素方差分析，2组间比较采用LSD检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死体积检测 TTC染色，正常脑组织呈红色，梗死组织呈白色。假手术组：大脑红染，未发现任何白色梗死区域。模型组出现明显白色梗死灶，主要集中在左侧大脑中动脉供血区（左侧前2/3脑区，外侧面的大部分和岛叶）;部分尾状核，豆状核、内囊膝和后肢的前部等部位也可见白色梗死区。给予清开灵注射液治疗后，白色梗死灶体积明显减小（P<0.05）。见表2，图1。

2.2 FKN浓度

2.2.1 脑脊液中FKN的浓度 蛋白芯片法检测脑脊液中FKN的表达水平结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死缺血性损伤24 h后，脑脊液FKN浓度为假手术组的2.7倍;与相同时间点模型组比较，清开灵注射液治疗后，脑脊液FKN浓度为模型组的1.05倍，是假手术组的2.85倍。见表3。

2.2.2 外周血清及脑组织中FKN的浓度 ELISA检测外周血清及脑组织中FKN的表达水平结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死缺血性损伤24 h，外周血清中FKN表达水平明显降低（P<0.05），与相同时间点模型组比较，清开灵注射液治疗后，外周血FKN表达显著升高，但是仍然低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）;与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死缺血性损伤24 h，脑组织中FKN表达水平降低，清开灵治疗后，FKN表达水平提高，但是三者之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.3 清开灵注射液对MCAO大鼠脑组织的形态学的影响 HE染色光镜下观察，假手术组脑组织结构清晰，神经元排列层次清楚，核居中，核仁清晰可见，可见胶质细胞散在分布，脑内微血管管壁完整。模型组缺血测脑半球可见明显的梗死灶，中心区神经元丢失，皮质区神经元排列紊乱，胞核和胞质界限模糊不清，核仁消失，胶质细胞也呈现不同程度水肿征象，脑内微血管管壁扭曲变形;清开灵观察组梗死灶较模型组有明显减小，神经元形态相对正常，间质炎性反应及水肿明显减轻。见图2。

2.4 清开灵注射液对大脑FKN表达的影响 免疫组化染色结果显示：FKN主要存在大鼠腦组织神经元及胶质细胞胞质，急性脑缺血24 h，血管内皮细胞也可以看到阳性表达。进一步分析平均光密度，结果显示，FKN在模型组的表达水平显著高于假手术组（P<0.01），而清开灵观察组的表达水平显著低于模型组，高于假手术组（P<0.01）。见表5、图3。

3 讨论

FKN是趋化因子家族中较少的在中枢神经系统中组成性表达的趋化因子之一，它是一种跨膜糖蛋白，分为膜结合型和可溶性分子2种形式存在。基于FKN在神经系统中独特的结构优势，近年来研究发现，FKN是中间神经元旁分泌途径中的始动及中心环节，促进中间神经元向少突胶质细胞分化形成[5]，也是一个能预示炎性反应及血管受损程度的新靶点[6]，能参与介导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向缺血脑组织的定向迁移[7]。国内文献报道也发现其能参与缺血性脑损伤的病理过程，在缺血性脑损伤中激活小胶质细胞，增加神经炎性反应[8]，更加证实了FKN在缺血性脑损伤中的作用。

本研究证实，正常脑组织FKN有一些组成性表达，主要分布在神经元及胶质细胞中，内皮细胞中未见明显表达，同文献报道一致[1];急性脑缺血24 h后，大鼠脑脊液中FKN表达含量升高，这与局部病变脑组织中FKN的表达趋势一致。脑微血管内皮细胞上可见FKN阳性表达，受损神经元及胶质细胞中FKN的表达亦有增加，这种变化同文献报道一致[2]。血清中FKN的变化同其在脑内的微环境中的变化趋势相反，急性脑缺血24 h，血清中FKN的表达明显减少。上述表达趋势在全脑组织的检测中并不显著。提示生理状态下，FKN主要由神经元表达，其受体在小胶质细胞有表达，急性脑缺血性损伤，血管内皮细胞具有分泌FKN的功能，推测其也是FKN表达活化的始动环节，神经元可能是通过内皮细胞分泌的信号因子刺激自身的FKN mRNA扩增，导致表达显著增加，作为特异性抗体表达的小胶质细胞，则更多是通过与FKN结合导致表达含量增多。

急性脑缺血属于中医“中风病”范畴。王永炎院士在多年临床实践基础上提出中风病“毒损脑络”学说认为中风病与毒邪致病相似，中风后产生痰、热、瘀等毒邪，入侵脉络（包括浮络、孙络和缠络），损伤络中正气，营卫失和，毒邪内生，强调痰毒、热毒及瘀毒互结，损伤脑络的理论观点。清开灵注射液来源于传统安宫牛黄丸，由黄芩苷、栀子、金银花、水牛角等组成，全方共奏清热解毒、化痰通络、醒神开窍之功效。本团队前期工作显示清开灵注射液能显著提高临床治疗急性脑缺血有效率，改善患者神经功能，降低血清炎性反应因子表达水平[9]，研究也发现清开灵注射液能明显减轻急性脑出血模型大鼠脑组织水肿程度，减轻炎性反应，减少脑组织损伤，加快清除体内自由基的作用[10]，药代动力学的研究也证实清开灵有效组分在大鼠脑缺血性损伤时代谢更加缓慢[11]。本研究发现，清开灵注射液能够显著下调急性脑缺血24 h后局灶病变脑组织FKN，上调血清FKN，缩小脑梗死体积，减轻脑损伤，提示清开灵注射液治疗急性脑缺血可能与调节FKN在脑内微环境表达有关，为该药临床治疗提供了生物学依据。

参考文献

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（2019-06-12收稿 责任编辑：王杨）

基金项目：西藏自治区藏医药区域协同创新中心第一批培育项目（2017XTCX014）——西藏产滇黄芩对脑缺氧损伤的保护作用研究;北京中医药大学东方医院1166·中青年专家项目（030903010302）

作者简介：刘豫玥（1985.02—），女，硕士，主治医师，研究方向：中医药防治中风病机制研究，E-mail：liuyuyue1985@126.com

通信作者：潘彦舒（1972.12—），女，博士，教授，研究方向：缺血性脑血管疾病的中西医结合基础研究，E-mail：13911209998@163.com