苗族酸酢鱼发酵过程中微生物群落、氨基酸及水分动态变化规律

王泽晗，陶昱豪，孙黎明，刘 嘉,2，杜 明，王震宇,*

（1.大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，海洋食品精深加工关键技术协同创新中心，辽宁 大连 116034；2.贵州省农业科学院 贵州生物技术研究所，贵州 贵阳 550006）

酸酢鱼是一种苗族特色传统发酵水产制品，以贵州为代表的中国西南地区自古缺少食盐资源，酸酢鱼通过发酵阶段，微生物的生长而随之产生酸性物质可降低产品pH值，从而达到延长蛋白类食品保质期的目的。酸酢鱼产品酸辣可口，具有鲜明的民族特色，是能够走向世界的、具有较高开发价值的传统民族水产制品[1]。但是现阶段酸酢鱼的加工方式主要以传统小作坊及家庭自制为主，其发酵过程中微生物菌群变化、产品品质变化规律等基础性问题尚未揭示，造成了产品发酵生产周期长、批次间品质不稳定等突出问题。为解决上述问题，挖掘传统工艺中酸酢鱼产品的品质变化规律对指导产品稳定化、规模化生产具有重要意义。本实验以传统制作工艺加工的苗族酸酢鱼为研究对象，对发酵过程中微生物菌群结构变化、游离氨基酸含量和水分分布动态变化进行了分析，为探索和实现这一传统美食的工业化奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丰鲤品种的鲤鱼35 条，每尾质量约2 kg，购买于大连市甘井子区仟和农贸市场。

氨基酸标准混合溶液 日立高新技术公司；BCA蛋白定量试剂盒 北京Solarbio有限公司；E.Z.N.A.®soil试剂盒 美国Omega BioTek公司；AxyPrep DNA Gel Extraction试剂盒 美国Axygen Biosciences公司。

1.2 仪器与设备

LA 8080氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；Flx800酶标仪 美国BioTek公司；QuantiFluor™-ST微型荧光计 美国Promega公司；NMI20-030H-1核磁共振成像分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸酢鱼制作

采用贵州苗族传统加工工艺制作酸酢鱼。将鲤鱼去掉头、尾、鳞和内脏；清洗后切段，将鱼切成每段约100 g；在鱼肉的内外均匀涂抹食盐，食盐使用量为鱼肉质量的8%；涂抹玉米粉，玉米粉的使用量约为加食盐前鱼肉质量的6%；涂抹后晾晒12 h以沥干水分；最后装罐密封，将鱼放置在25 ℃左右的环境中发酵。在发酵第0、2、4、8、12、18、24天时取鱼肉样品，样品一式3 份，取出的样品在－80 ℃保存。

1.3.2 聚合酶链式反应扩增

使用E.Z.N.A.®soil试剂盒将样品中细菌的总DNA抽提出来，利用Nano Drop 2000检测DNA的浓度和纯度，再用1 g/100 mL琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。选用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），通过此引物扩增细菌基因的V3-V4可变区，扩增时首先95 ℃预变性3 min，之后以95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq测序及数据处理

利用QuantiFluorTM-ST微型荧光计进行检测定量。利用Illumina公司的MiSeq PE300平台对纯化的样本进行细菌rRNA基因的高通量测序分析。使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。利用软件Mothur 1.30.1分析，用于微生物单样本多样性（a多样性）指数的计算。

1.3.4 游离氨基酸的测定

称取发酵第0、2、4、8、12、18、24天的鱼肉3 g，加入12 mL去离子水，7 000 r/min匀浆2 min。将所获得的匀浆液4 ℃、10 000×g离心10 min。取0.5 mL的上清液加入1 mL丙酮，充分摇匀，静置5 min；10 000×g、4 ℃离心15 min，离心后的上清液氮气吹干。加入0.02 mol/L的盐酸溶液1 mL进行复溶，经过0.22 μm滤膜过滤，采用LA 8080氨基酸分析仪进行测定。

在电力行业的市场化运营中，市场需求的不确定性和风险偏好直接影响到购电商的决策。研究基于用电户随机需求构建购电商决策模型，用前景理论刻画购电商的风险规避度，为购电商提供最优决策。结论表明购电商最优购电量随市场风险或零售价格的增大而增大；购电商最优购电量随购电商风险规避度、批发价格或销售变动成本增大而减少。以上结论为电力体制改制背景下的电力企业最优决策提供了理论参考。

1.3.5 低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术检测水分分布

在NMI20-030H-1核磁共振成像分析仪上，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列[2-3]，磁场强度（0.50±0.08） T，测量温度为25 ℃。首先沿肌纤维方向取3.5 g鱼肉，修整为20 mm×10 mm×10 mm的样品3 份，分别放入直径40 mm的检测管中。选用Q-CPMG序列测定横向弛豫时间T2，其参数值为：采样频率200 MHz，累加次数4，射频频率21 MHz，采样等待时间5 500 ms，回波数1 500，射频延时0.080 ms，回波时间0.500 ms；脉冲宽度（pulse width，PW）在90°为26.00 μs（PW1），在180°为54.00 μs（PW2）。每次测试重复3 次。

1.4 统计分析

所有结果使用SPSS 22.0软件进行统计和方差分析（P＜0.05），确定数据的差异显著性。结果表示为±s。作图使用Origin 2018软件。

2 结果与分析

2.1 α多样性指数分析

对传统酸酢鱼不同发酵时间的样本提取总细菌DNA，经过处理后运用Illumina HiSeq PE250平台对操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）进行测序分析，采用Sobs指数、Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、Chao指数、覆盖率等多样性指数对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估，结果如表1所示。

表1 酸酢鱼的微生物DNA序列信息和微生物多样性指数Table 1Sequence abundance and microbial diversity indices in Suanzuo fish

在酸酢鱼中有效序列有429 062 条，191 种OTU。有效序列越多，进入分类的序列也越多。各样品的覆盖率均大于0.999，说明本实验的测序量已经达到饱和，测序的结果能够有效反映酸酢鱼在发酵过程中微生物菌群多样性组成。随着发酵时间的延长，酸酢鱼中样品的细菌多样性总体呈现迅速下降然后缓慢上升再下降的趋势。在发酵初期到第4天，OTU数从122下降到50，Chao指数从133.000 00下降到62.363 64，表明样品初始种类丰富度开始下降，原因是由于加入盐腌制可杀死一些细菌，无氧的条件中，一些微生物的生长也受到抑制。在发酵第4～24天，OTU数、Chao指数、Shannon指数等多样性指数的浮动趋势不大，样品中的微生物在逐渐适应生长环境，细菌数量趋于平稳。

2.2 发酵过程中细菌群落结构变化

根据分类学分析结果，传统发酵酸酢鱼中微生物群落结构组成主要分布有4 个门类群、5 个纲类群、9 个目类群、14 个科类群、10 个属类群，各发酵阶段的酸酢鱼所含原核微生物门水平、目水平和属水平的种类基本相似，但是相对丰度随着发酵进程发生一定改变。

图1 苗族酸酢鱼发酵过程中微生物物种在门水平（A）、目水平（B）、属水平（C）的相对丰度Fig.1 Relative abundance of bacterial community members at (A)phylum, (B) order and (C) genus levels in Suanzuo fish

由图1B可知，在目水平上，酸酢鱼的细菌群落结构分布中主要有厚壁菌门的芽孢杆菌目（Bacillales）、乳酸杆菌目（Lactobacillales）；放线菌门的放线菌目（Actinomycetales）、微球菌目（Micrococcales）；变形菌门的肠杆菌目（Enterobacteriales）、海洋螺菌目（Oceanospirillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、立克次体目（Rickettsiales）、假单胞菌目（Pseudomonadales）；以及拟杆菌门中的黄杆菌目（Flavobacteriales）。其中酸酢鱼发酵过程中的芽孢杆菌目的相对丰度一直较高，其对应值在发酵第4天达到最大。其次是乳酸杆菌目，发酵前期虽生长不明显，但是其相对丰度在发酵8～12 d显著增加，此后略有波动，但是整体呈现增加趋势，并在发酵第24天结束时达到丰度的最大值，这也与酸酢鱼发酵时逐渐产酸的过程相一致。放线菌门的微球菌目在发酵初期存在，但是很快消失，发酵后期，即发酵的第12、18天，放线菌门相对丰度的增加主要是由放线菌目的相对丰度增长引起的。

如图1C所示，发酵初始阶段的酸酢鱼发酵体系中优势菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus），其隶属于厚壁菌门、芽孢杆菌目，该菌属大部分为非致病菌，其能够利用糖类产酸，可将蛋白质降解为微分子肽和游离氨基酸[4-5]，为发酵后期的乳酸杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）等典型乳酸菌的生长和繁殖提供营养，在发酵第24天葡萄球菌属的相对丰度为64.65%，其相对丰度始终维持在60%以上，是贯穿酸酢鱼整个发酵周期的优势菌属。此外芽孢杆菌目的巨球菌属（Macrococcus）、乳酸杆菌目的乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属和四联球菌属（Tetragenococcus）也在酸酢鱼的发酵过程中起到了关键作用。根据相关报道，整个发酵过程中，巨球菌属具有水解蛋白质和脂类的能力，不仅为发酵后期乳酸菌的生长发育及产酸提供丰富营养，同时脂类的降解也释放出丰富的挥发性风味物质，形成发酵鱼制品独特的产品风味[6-7]。在中国传统的发酵鱼制品的臭鳜鱼中也发现了巨球菌属[8-10]。在酸酢鱼发酵的中后期，以乳杆菌属、魏斯氏菌属和四联球菌属为代表的乳杆菌目微生物的相对丰度开始显著增加，上述3 个种属的微生物均属于乳酸菌，其广泛存在于发酵食品微生物群落中，在其他发酵食品的微生物群落分析中被广泛报道[11-12]。乳酸菌的生长会加速乳酸积累，迅速降低发酵体系的pH值，进而抑制放线菌目的罗斯氏菌属（Rithia）、海洋螺菌目的食碱菌属（Alcanivorax）和假单胞菌目的不动杆菌属（Acinetobacter）等常见食源性污染微生物的生长。

2.3 呈味氨基酸变化规律

酸酢鱼中的游离氨基酸主要来源于鱼肉自身的蛋白酶和微生物共同分解的蛋白质[13-14]。游离氨基酸是酸酢鱼发酵过程的主要代谢产物之一。由表2可知，在苗族酸酢鱼样品中含量丰富的有苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和赖氨酸（Lys）。发酵到第24天，酸酢鱼中总游离氨基酸含量为1 406.09 mg/100 g，与新鲜鱼肉相比，总游离氨基酸含量增加了3.69 倍，必需氨基酸的含量增加了7.6 倍。此外，随着发酵进程的进行，游离氨基酸含量在发酵第4天和发酵第8天出现了显著增加的现象。同时，微生物群落结构在第4天时，以葡萄球菌属和巨球菌属为代表的芽孢杆菌目微生物的相对丰度达到最大值。2 个菌属微生物的快速增长不但极大地压缩了原生食品污染微生物的生长空间，还通过产酶降解蛋白质、脂类产生的氨基酸等小分子有机物，为发酵中后期乳酸杆菌目微生物的生长提供了丰富的营养物质基础。

表2 不同发酵时间的酸酢鱼中游离氨基酸的含量Table 2 Changes in the contents of free amino acids in Suanzuo fish during fermentation mg/100 g

除了提供微生物生长的营养，氨基酸还是关键的呈味物质，对产品风味的形成有重要作用，鱼肉中的氨基酸和酸酢鱼独特浓郁的风味有着密切的关系[15-16]。采用味道强度值（taste activity value，TAV）对各种呈味氨基酸进行分析。TAV通常以化合物的浓度和其阈值的比计算[17]，如果TAV大于1，则认为该氨基酸对于食物的滋味具有显著的贡献；如果TAV小于1，则该氨基酸对滋味的呈味效果不显著。天冬氨酸（Asp）和Glu为酸味氨基酸，Thr、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、Ala、脯氨酸（Pro）和Lys是甜味氨基酸，Val、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、Leu、Tyr、Phe、组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）是苦味氨基酸。酸酢鱼中游离氨基酸的TAV如表3所示，TAV越大，表示氨基酸的呈味作用越明显，对产品滋味的贡献也越大。发酵成熟的贵州酸酢鱼中的呈味氨基酸有Asp、Glu、Ala、Val、Met、Phe、Lys和His。Glu的TAV为30.69，对贵州酸酢鱼的整体滋味贡献最为显著，能够显著提高鱼肉的鲜味。His是苦味氨基酸，具有增添食品呈味复杂度的功能，并且具有提高食品鲜味的能力。产品无明显苦味的原因可能是各种呈味氨基酸呈现不同的口味，多重口味互相消减[18]，此外Glu还能够与呈味5’-核苷酸发生协同作用，从而提升鲜味[19]。

表3 不同发酵时间酸酢鱼中氨基酸TAV的变化Table 3Changes in TAV of free amino acids in Suanzuo fish during fermentation

2.4 水分变化规律分析

LF-NMR能够显示不同鱼肉样品中水分的分布，为分析鱼肉中水分分布状态和产品品质特性之间的关系奠定理论基础[20]。通过采用LF-NMR技术对酸酢鱼进行检测，分析所得的弛豫时间T2的数据分布揭示了酸酢鱼的不同水分状态。横向弛豫时间T2可以间接表示水的自由度，T2的横向弛豫时间越长，水就越自由；相对面积反映不同分布状态水分含量的变化。

如图2所示，3 个峰表示发酵过程中水分的3 种分布：T21（0.1～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（200～1 000 ms）。不同的水分分布弛豫时间T2和所占面积对应着鱼肉中不同状态的水。T21（0.1～10 ms）代表与蛋白质等大分子表面紧密结合的水分子层，水分单分子层与蛋白质羰基、氨基结合，是不会受外界压力影响的结合水组成的分子层。T22（10～100 ms）代表的水分子存在于高度组织化蛋白质结构中，是位于肌原纤维和膜之间不易流动的水分子，这部分水的峰面积约占总水量的80%以上。T23（100～1 000 ms）是指存在于肌细胞外空间、靠毛细管凝结作用聚集的，且具有流动性的自由水[21-23]。近年来，根据肉与肉制品水分T2分布的理论研究，已有研究者分析肉中水分的分布和流动性对其品质特性的影响[24-25]。Xu Yanshun等[26]在不同阶段发酵香肠模型的系统实验中，发现了3 种水分分布状态，并且肉制品发酵成熟的过程可看作是向更短的弛豫时间转变的过程。

图2 酸酢鱼在发酵过程中弛豫时间T2分布图Fig.2 Changes in distribution of T2 relaxation time in Suanzuo fish during fermentation

由图2可知，贵州酸酢鱼在发酵第4天后的结合水向更强结合方向迁移。此外，随着酸酢鱼的发酵，鱼肉中自由水含量逐渐减少，可能是因为盐腌形成鱼肉与环境中的渗透压差异，导致部分自由水渗出鱼肉外造成鱼肉内部自由水含量降低[27]。另外，发酵时微生物的生长繁殖消耗了部分自由水，也能够形成相似的结果。而不易流动的水分在发酵第8天之后的自由度显著下降说明鱼肉肌原纤维中束缚的水分更加牢固。

在酸酢鱼发酵阶段中，不同水分（结合水与不易流动水）对应的弛豫时间和相对面积（T21和T22）的变化如表4所示，随着发酵时间的延长，T21和T22的相对面积随着发酵进程逐渐变小，弛豫时间也大体呈现逐渐降低的规律，水分自由度也随发酵进程逐渐下降。

表4 贵州酸酢鱼中弛豫时间（T21和T22）和相对面积的变化Table 4Changes in relaxation time (T21 and T22) and relaxation area ratio in Suanzuo fish during fermentation

值得注意的是，不易流动水的相对含量以及弛豫时间在酸酢鱼发酵第4天和第8天明显降低，这与微生物菌群结构的变化也具有相关性。在第4天和第8天时，芽孢杆菌目微生物快速生长，达到了其相对丰度的最大值，而以葡萄球菌属和巨球菌属为代表的芽孢杆菌目微生物快速生长，能够快速降解蛋白质积累的营养物质，此时鱼肉中肌原纤维蛋白发生一定程度的崩解，鱼肉组织的保水能力下降，使得被束缚的不易流动水含量发生显著性降低，因此自由水流失；同时由于发酵后期，以乳酸杆菌属和魏斯氏菌属为代表的乳酸杆菌目微生物开始大量生长，发酵体系中开始逐渐积累乳酸，较低的pH值可能会促进蛋白质凝胶化，并产生聚集物，由于发酵体系从黏性蛋白系统转变为胶体黏性蛋白系统，且蛋白质链间相互作用，因此形成了紧密结合的蛋白质网络，极大地增加了水分子流动的难度，导致了水分子不易流动，因此水的自由度降低[28-29]。本实验现象与Yang Zhaoxia等[10]的研究结论类似，发酵过程中臭鳜鱼样品结构特性和水分状态的变化高度相关，肌原纤维束间的作用逐渐减弱，不易流动水的含量降低，水的自由度随发酵时间增加而逐渐降低[30]。不同于自由水的流失和不易流动水的减少，结合水始终紧密结合在蛋白质大分子的表面，绝对含量并未发生显著变化，最终造成了相对含量逐渐升高的现象。

本实验与已经报道的酸酢鱼发酵过程中质构变化相比较发现，随着发酵的进行，自由水和不易流动水的含量均显著降低，此时鱼肉的保水能力显著下降，肉质硬度逐渐升高、弹性显著下降[1]。

3 结 论

苗族传统酸酢鱼的发酵过程中，发酵前期的优势菌主要是葡萄球菌属和巨球菌属，二者能够有效降解蛋白质和脂类，发酵过程中游离氨基酸的含量随着发酵时间的延长而增加，积累营养物质的同时，释放发酵酸酢鱼的特征挥发风味物质。随着发酵过程中乳酸菌的繁殖，一些腐败菌如肠杆菌属等食品污染微生物的相对丰度逐渐降低；乳酸杆菌属和魏斯氏菌属利用前期积累的营养物质在发酵中后期快速生长，并积累乳酸，有效地抑制了原生食品污染微生物的生长。酸酢鱼发酵过程中的氨基酸是其关键呈味物质，Glu对贵州酸酢鱼的整体滋味贡献最为显著，能够显著提高鱼肉的鲜味。鱼肉中水分分布的整体趋势向更低自由度的方向迁移，水分的流动性变差，自由水和不易流动水的相对含量逐渐降低，结合水的相对含量显著升高，进而可能影响到酸酢鱼的质构。