油松花粉离体萌发培养基及花粉贮藏条件研究

于庆福

(喀左县林业种苗技术服务中心，辽宁 喀左 122300)

油松Pinustabulaeformis为松科松属常绿乔木，我国特有树种。针叶深绿色，2针1束，雌雄同株，花期为每年的4-5月，球果翌年10月成熟。油松为喜光、深根性树种，喜干冷气候，在土层深厚、排水良好的酸性、中性或钙质黄土上均能生长良好[1]。油松为我国北方地区重要的用材树种之一，也是水土保持和城乡绿化的重要树种，具有重要的经济和生态价值。

在开展油松杂交育种和油松种子园控制授粉等工作中，常进行花粉贮藏和生活力测定，这样可避免无活力花粉的使用，否则将导致杂交计划的失败[2-3]。因此一种有效的花粉生活力检测方法及花粉贮藏条件的探索，对确保油松杂交和控制授粉的成功具有重要意义。本研究采用正交试验设计，筛选适合油松花粉萌发的离体培养基，并对不同贮藏温度及时间的油松花粉生活力进行检测与评价，为油松人工授粉和杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

油松雄花序于2019年5月6日采自沈阳农业大学植物园。

1.2 方 法

1.2.1 花粉采集

采集发育正常即将散粉的油松雄花序，装入袋内，带回实验室。将采集回来的雄花序平铺在硫酸纸上，放置24 h，待其散粉后，用镊子夹住花序轻轻将花粉抖落，筛除杂质后备用。

1.2.2 花粉贮藏

将花粉分别装入1.5 mL离心管中，做好标记，然后将装有花粉的离心管分别在常温(25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃条件下各贮藏10管。

1.2.3 花粉萌发离体培养基的筛选

以采集的油松新鲜花粉为试材，采用L9(34)正交表进行培养基筛选，因素和水平见表1，研究蔗糖、硼酸和pH值3个因素不同水平对油松花粉离体萌发的影响。培养基均添加琼脂8 g·L-1，培养基制好后倒在直径100 mm培养皿中，培养基厚度3 mm，待自然冷却至室温后，将花粉均匀地撒在培养基上，盖上盖，置于(25±1)℃ 培养室中培养72 h后，在光学显微镜下观察花粉的萌发情况。观察显示：培养24 h的油松花粉无明显萌发迹象；培养48 h的油松花粉虽已萌发，但不适于观察和统计萌发率；培养72 h的油松花粉完全萌发，便于观察和统计萌发率。以花粉管的长度超过花粉粒直径的1.5倍为花粉萌发标准，每个培养皿取3个视野，统计其平均萌发率，重复4次。通过极差分析和方差分析筛选适宜油松花粉萌发的培养基。

表1 正交试验因素和水平

1.2.4 不同贮藏条件对花粉生活力的影响

采用优化的培养基测定油松初始萌发率后，将油松花粉分别放在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃和25 ℃ 条件下贮藏，待花粉在4种温度条件下贮藏15 d、30 d后，各取出1管，在优化的培养基上进行培养，72 h后统计萌发率。

1.3 数据处理

应用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，S-N-K法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 花粉萌发离体培养基的筛选

由表2可知，蔗糖的R值最大，pH值的R值最小，说明此试验设计下蔗糖不同质量浓度对油松花粉萌发的影响最大，其次是硼酸，影响最小的是pH值；从平均值来看，蔗糖质量浓度的第1水平最好，硼酸质量浓度的第2水平最好，pH值的第2水平最好，说明最佳培养基是蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1，pH值6.5。

表2 油松花粉离体萌发培养基筛选的极差分析

由表3可知，在该试验条件下，蔗糖和硼酸两个因素不同水平对油松花粉萌发的影响均达到极显著水平，pH值不同水平对油松花粉萌发的影响不显著。

表3 油松花粉离体萌发培养基筛选的方差分析

由表4可知，蔗糖100 g·L-1对油松花粉萌发的效果最好，150 g·L-1的效果次之，200 g·L-1的效果最差，且三者间差异均达到了极显著水平；硼酸0.1 g·L-1的效果最好，0.2 g·L-1的效果次之，0.05 g·L-1的效果最差，0.1 g·L-1和0.05 g·L-1花粉萌发率的差异达到极显著水平；但0.1 g·L-1与0.20 g·L-1、0.20 g·L-1与0.05 g·L-1对花粉萌发率的影响均未达到极显著水平；不同pH值对油松花粉萌发的影响未达到显著水平。

表4 油松花粉离体萌发培养基筛选的多重比较

根据极差分析、方差分析和多重比较结果，筛选出油松花粉萌发的离体培养基为蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+琼脂8 g·L-1，pH值6.5，该培养基位于设计的第二个组合，测定油松新鲜花粉萌发率为93.12%，即花粉贮藏前的初始萌发率为93.12%。

2.2 不同贮藏条件对花粉生活力的影响

由表5可知，-80 ℃条件下油松花粉贮藏15 d和30 d后萌发率分别为92.93%和91.27%，两者与新鲜花粉的萌发率差异不显著；-20 ℃条件下花粉贮藏15 d和30 d的萌发率分别为92.24%和88.65%，其中贮藏30 d后的萌发率与新鲜花粉的萌发率差异达到极显著水平；4 ℃条件下花粉贮藏15 d和30 d后的萌发率分别为90.69%和86.84%，贮藏30 d后的萌发率与新鲜花粉的萌发率差异达到极显著水平；25 ℃条件下贮藏15 d和30 d的萌发率分别为90.27%和82.66%，与新鲜花粉萌发率差异均达到极显著水平。

表5 4种贮藏温度下花粉萌发率的多重比较 %

3 讨论与结论

沈静华等研究蔗糖质量浓度和硼酸质量浓度对油松花粉生活力的影响时，得出在蔗糖10%+硼酸0.01%的固体培养基上，油松新鲜花粉萌发率可达98.6%[4]。本研究首次采用正交试验设计，通过统计分析得出适宜油松花粉萌发的离体培养基为蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+琼脂8 g·L-1，pH值6.5，新鲜花粉的萌发率为93.12%，筛选的固体培养基在蔗糖质量浓度和硼酸质量浓度上与沈静华等的结论一致；同时本试验中蔗糖为油松花粉萌发的最主要影响因子，蔗糖质量浓度为100 g·L-1的油松花粉萌发率最高，与周强等研究樟子松花粉适宜萌发培养基中的蔗糖质量浓度也一致[5]。

不同温度贮藏的油松花粉，随贮藏时间延长，生活力降低；贮藏温度越低，花粉生活力下降得越缓慢，贮藏温度越高，花粉生活力下降就越快。这是因为花粉贮藏过程中保持较低温度，能够使花粉代谢受到抑制，酶活性减弱，呼吸作用降低，从而能够使花粉长时间地维持生活力，这一结论与吴月亮等[6]、张慧会等[7]、Wang等[8]对花粉生活力与贮藏性的研究结论一致。

本项研究中油松花粉在4种温度下贮藏30 d，均能保持较高生活力，对开展油松授粉解决花期不遇和异地运输等时空问题具有重要的实际意义。