彩色蛋白凝胶试剂盒概论

何志昂 梁彩娇 姜维

深圳市达科为生物工程有限公司 广东 深圳 518000

引言

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法为化学聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶。

研发一款蛋白电泳彩色凝胶试剂盒（BioSci™ NewFlash Protein AnyKD Color PAGE Kit），需要满足低丙烯酰胺产品，该产品使用了最新的凝胶技术降低丙烯酰胺浓度，提高凝胶速度。该凝胶试剂盒操作简便，配胶快速安全，无TEMED试剂，无特殊气味，且提供彩色染料染色浓缩胶.彩色上层胶，易于上样。蛋白胶凝固快，25 min即可完成整个制胶过程。可以高电压快速电泳，300 V恒压25 min左右即可完成电泳，也可进行常压电泳。适用于(10 ～ 250) kDa蛋白的分离鉴定，无须根据蛋白大小调整分离胶浓度。

1 材料和方法

1.1 设计

彩色蛋白胶分别与无色蛋白胶进行蛋白电泳测试

1.2 材料

蛋白mark（Dakewe Cat.No.8011021，8011031），NK细胞总蛋白（Dakewe 提取），电泳缓冲液（Dakewe Cat.No.8015021），蛋白上样缓冲液（Dakewe Cat.No.8015011），蛋白染色液（Dakewe Cat.No.8019011），蛋白电泳仪（北京六一仪器 DYY-2C）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组。实验设置5个组，分别为实验组1（红色凝胶），实验组2（黄色凝胶），实验组3（绿色凝胶），实验组4（紫色凝胶），对照组（无色凝胶）。加入等量的Mark与总蛋白样品，蛋白染色脱色相同时间。

1.3.2 制胶。分离胶A液和B液1∶1混匀，配胶可以使用15mL或50mL离心管配制。浓缩胶A液和B液1∶1混匀，然后加入浓缩胶体积0.4%～0.7%的浓缩胶染液（建议3mL浓缩胶加30ul浓缩胶染液，加入对应颜色染料于浓缩胶的即为对应的实验组不加染料的即为对照组）。

向上述分离胶溶液中加入10% APS溶液（5mL加50μL），混匀后灌入模具中，分离胶溶液加至距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm，迅速小心加入水、无水乙醇或异丙醇覆盖分离胶。待分离胶凝固（3 ～ 10 min）后，倒掉覆盖液，用去离子水冲洗分离胶顶部数次以去除未聚合凝胶，排除顶部液体、用滤纸吸走残留的去离子水。在上述浓缩胶溶液中加入10% APS溶液（2mL加20μL的10% APS溶液），混匀后灌入分离胶，将梳子插入凝胶内，静置15～20 min，等待凝胶聚合。

1.3.3 上样电泳。凝胶聚合后拔出梳子、上样。Marker使用BioSci™ ColorBand Prestained Protein Marker（Cat.No.8011011& 8011021 & 8011031），上样缓冲液使用BioSci™ SuperDrop SDS-PAGE Protein Loading Buffer 5×（Cat.No.8015011）。各组上样相同量蛋白Mrak与总蛋白，在电泳缓冲液中实现快速电泳，电压最高设置为300V，25min左右完成电泳，电流最大不要超过140mA，如果电流过大产热多，可降低电压。电泳缓冲液使用BioSci™ Tris Glycine SDS Running Buffer (10×)（Cat.No.8015021）。

1.3.4 蛋白染色洗脱。电泳后，各组的蛋白凝胶放置在干净的容器中，加入300～400mL纯水摇晃清洗5分钟，重复3次。弃去纯水，加入适当体积（覆盖凝胶为宜）的SpectBlue染色液（Cat.No.8019011）。置于摇床上染色15～30min。染色结束后，弃去染色液，加入纯水洗涤去除残留染色液，即可观察结果。加入200mL纯水进行脱色，可每隔20min更换纯水进行漂洗，重复3～4次即可得到极低背景的凝胶[1]。

1.3.5 观察拍照。观察各组蛋白凝胶的条带清晰度，染料是否迁移等，并拍照记录结果。

2 结果分析

2.1 各组电泳上样前结果如下图

图1中abcde分别为红、黄、绿、紫、无色蛋白凝胶制胶后的图片，可以看出有色浓缩胶颜色鲜艳，浓缩胶与分离胶界限清晰，无色蛋白凝胶的浓缩胶与分离胶无明显界限。

图1 各组电泳上样前结果图

2.2 各组电泳上样中结果

图2中abcde分别为红、黄、绿、紫、无色蛋白凝胶上样中的图片，可以看出有色浓缩胶颜色鲜艳，浓缩胶的梳孔在电泳缓冲液中清晰可见上样非常方便，无色蛋白凝胶的梳孔浓缩胶在电泳缓冲液中非常模糊难以分辨。

图2 各组电泳上样中结果图

2.3 各组电泳中的结果如下图

图3中abcde分别为红、黄、绿、紫、无色蛋白凝胶电泳中的图片，可以看出有色浓缩胶颜色鲜艳未褪色也为发生迁移扩散，电泳条带与无色蛋白凝胶无差别。

图3 各组电泳中的结果图

2.4 各组电泳染色后的结果

图4中abcde分别为红、黄、绿、紫、无色蛋白凝胶电泳中的图片，可以看出有色浓缩胶颜色鲜艳未褪色也为发生迁移扩散，电泳条带与无色蛋白凝胶无差别[2]。

图4 各组电泳染色后的结果图

3 讨论

市面上的SDS-PAGE蛋白凝胶常用的浓缩胶是无色透明，在无色的电泳缓冲液中，很难看清蛋白上样梳孔，我们研发的彩色SDS-PAGE蛋白凝胶，浓缩胶可以选择红、黄、绿、紫四种颜色。在无色的电泳缓冲液中，可以清晰看清蛋白上样梳孔，极大地提高了上样的辨识性，减少了蛋白上样的错误率。此外所用的浓缩胶彩色染料是惰性染料，长期保存也不会发生颜色改变。染料鲜艳且可以非常均匀的染色浓缩胶，在电泳的过程中染料颜色没有发生迁移也没有颜色变淡，也没有与Mark或蛋白结合而影响其电泳迁移。浓缩胶染料可以清晰地分界浓缩胶与分离胶方便做蛋白Westen时准确的分离切除浓缩胶。也可以根据不同的样品选择不同的颜色的蛋白凝胶，从颜色上更加方便的区分不同样本的电泳的结果。