5 种蒿属植物提取物对马铃薯晚疫病的抑菌活性研究

何彦仪 罗雨薇 许美滢 竺永金 郑红宇 胡世俊 闫晓慧

（1.西南林业大学生物多样性保护学院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650233；2.西南林业大学林学院，西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南 昆明 650233）

马铃薯晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophtora infestans）引起、对马铃薯（Solanum tuberosum）具有毁灭性的疾病[1]。马铃薯晚疫病在全球范围内广泛传播、危害大、难防控，已经超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第1 大作物病害[2-3]。马铃薯晚疫病的防治措施均以化学防治为主，辅以简易的生物防治与物理防治。化学农药的使用次数和剂量的增加在一定程度上促使致病菌株产生抗药性，造成环境污染与农药残留等问题，导致防治效果降低[4]。植物源农药具有对生态环境安全、非靶标生物影响较小、原材料来源广泛等优点，因此从植物中寻找新的杀菌抑菌活性物质、研制开发新型植物源农药是当下的热点[5]。

牛尾蒿（Artemisia dubia）隶属菊科（Compositae）蒿属（Artemisia），为中国特有种，生于海拔3500 m 以下的山坡、草原、疏林及林缘地，主要分布于内蒙古、甘肃、四川、云南、西藏等省份[6]。研究表明，蒿属植物及其活性化合物被认为具有抗疟、抗氧化、驱虫、神经保护、抗炎和抗微生物等作用[7]。牛尾蒿为我国传统藏药，可作牲畜饲养材料；结合已有文献报道，牛尾蒿具有多种生物活性，如对烟草甲（Lasioderma serricorne）具趋避活性、抗猪流行性腹泻病毒等[8–10]；目前牛尾蒿在应用研究上大多为药用上的研究，有研究指出牛尾蒿提取物对人体致病菌，如白色念珠菌（Candida albicans）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）和大肠杆菌（Escherichia coli）均有不同程度的抑制活性[11]。

本研究以5 种蒿属植物的乙醇提取物为供试材料，对2 株马铃薯晚疫病菌进行菌丝生长抑制活性测定并进行活性成分筛选，为深入研究其抑菌活性成分、防治马铃薯晚疫病提供了新思路，也为植物源新农药的先导化合物开发提供科学依据[12-13]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

植物材料于2018 年5—8 月份采自云南昆明（102°10′～103°40′E，24°23′～26°22′N）、辽宁喀左（119°24′～120°23′E，40°47′～41°33′N）（表1），由西南林业大学胡世俊副教授鉴定，植物样品保存于云南省森林灾害预警与控制重点实验室。

表1 供试植物名录Table 1 List of tested plants

1.1.2 供试菌株

马铃薯晚疫病菌pn5502 和pn7604 菌株，由云南省农科院赵志坚研究员提供。

1.1.3 培养基

本实验采用黑麦培养基。按照黑麦60 g、琼脂18 g、白砂糖15 g、水1000 mL 的比例制作黑麦培养基。

1.2 仪器与试剂

N−1100 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司，中国）、柱层析硅胶及GF254 薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂，中国）；72%霜脲·锰锌可湿性粉剂（上海杜邦农化有限公司，中国），试剂甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿及二甲基亚砜（云南杨林汕滇药业有限公司，中国）等试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 植物提取物及牛尾蒿提取物不同馏分的制备

植物材料风干粉碎，采用乙醇回流提取法[14]，分别提取3 次，每次4 h。合并3 次提取液，再用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，得到乙醇提取物备用。牛尾蒿提取物经常压硅胶柱层析，以石油醚、石油醚−丙酮（V石油醚∶V乙酸乙酯=30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1）、氯仿−甲醇（V氯仿∶V甲醇=1∶1）等溶剂系统依次进行梯度洗脱，经薄层层析检测，合并相同组分，旋转蒸发浓缩回收溶剂，得到Fr1～Fr1010 个不同馏分。

1.3.2 抑菌活性测定方法

已纯化的马铃薯晚疫病菌在无菌环境下挑取菌丝接到黑麦培养基上进行继代培养，每4～5 d进行1 次，直至病菌长满平板，在菌落边缘打菌饼备用[15]。采用带毒平板法[16-17]测定5 种蒿属植物粗提物抑菌活性，将植物提取物用二甲基亚砜（DMSO）配置成100 mg/mL 的母液并采用巴氏消毒法对母液进行灭菌备用，无菌条件下将一定量的母液加入即将冷却的已灭菌黑麦培养基中并充分混匀，使提取物最终浓度为1 mg/mL，以含等量DMSO 溶剂的黑麦培养基作为空白对照（CK），阳性对照为同浓度的霜脲·锰锌。待培养基凝固后，每皿中央接入1 个菌饼（Φ=5 mm），每个处理重复3 次；28 ℃电热恒温培养箱中培养，采用十字交叉法对菌落进行测量，记录其平均直径。按公式（1）～（2）计算抑制率。

1.3.3 抑制中浓度（EC50）测定方法

将牛尾蒿乙醇提取物馏分Fr1制成0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL 5 个浓度的带毒平板，观察2 株马铃薯晚疫病菌的生长情况，根据Fr1在不同浓度下对2 株菌的抑制效果，分别针对2 株菌设定浓度梯度进行毒力测定：1）对菌株pn7604 浓度为62.5、31.25、15.625、7.8125、0 μg/mL；2）对菌株pn5502 浓度为1、5、2.5、1.25、0 μg/mL。

1.4 数据分析

运用SPSS 22.0 软件统计，采用单因素方差分析进行差异显著性分析，分别求出各供试组分的毒力回归方程、EC50值、95%置信区间和决定系数（R2）。

2 结果与分析

2.1 5 种植物粗提物的抑菌活性

由表2 可知，5 种植物提取物在1 mg/mL 下对2 株供试病原菌有不同程度的抑菌作用，抑菌率为28.08%～89.04%，不同提取物抑菌作用存在极显著差异（P<0.01），其中牛尾蒿提取物对供试菌株pn5502、pn7604 的抑菌活性最强，抑菌率分别为89.04%和71.38%。

表2 5 种植物粗提物对马铃薯晚疫病菌菌株pn5502、pn7604 的抑制率Table 2 Results of the antifungal activities of 5 plant crude extracts against pn5502 and pn7604 strains of P. infestans

2.2 牛尾蒿各馏分对供试菌株的抑菌活性筛选

由表3 可知，馏分Fr1在0.5 mg/mL 下对2 株供试菌有显著抑菌活性，抑制率均高达100%，此外馏分Fr2、Fr5、Fr6也显示出较高的抑菌效果，抑菌率均在50%以上。

表3 牛尾蒿的不同馏分对马铃薯晚疫病菌菌株pn5502 的抑制率Table 3 Antifungal activity of different fractions of A.dubia against pn5502 of P. infestans

根据表4 的活性测定结果，拟合出各提取物的毒力方程见表5；阳性对照对pn5502、pn7604 的EC50分别为273.8000、155.0000 μg/mL；Fr1对pn5502、pn7604 的EC50分别为7.4733、9.4634 μg/mL，明显高于阳性对照。

表4 牛尾蒿馏分Fr1 浓度梯度活性筛选Table 4 Concentration gradient activity screening of A.dubia Fr1

表5 Fr1、霜脲·锰锌对pn5502、pn7604 抑制的回归分析Table 5 The concentration for 50% of maximal effect of Fr1,cymoxanil·mancozeb on pn5502 and pn7604

2.3 牛尾蒿提取物对菌丝形态的影响

由图1 可知，牛尾蒿Fr1馏分处理后的2 株马铃薯晚疫病菌与CK 有明显差异。正常生长的pn5502、pn7604 菌丝体粗细均匀、表面光滑、分枝较少、发育正常、内含物丰富且均匀分布，受抑制的菌丝均产生明显的畸变，Fr1（31.25 μg/mL）处理的pn5502、pn7604 菌丝变得粗大分枝较多，且分枝间距密集，菌丝体内含物聚集，细胞壁不光滑，出现明显畸形。霜脲·锰锌（250 μg/mL）处理的pn7604 菌丝形态与Fr1（31.25 μg/mL）处理相似，表明馏分Fr1对pn5502、pn7604 菌丝生长有明显的抑制效果，且活性明显高于阳性对照。

图1 pn5502、pn7604 菌丝生长情况显微图Fig.1 Micrograph of mycelium growth of pn5502 and pn7604

3 结论与讨论

目前防治马铃薯晚疫病主要依靠培育抗病品种和施用化学药剂，由于致病疫霉遗传变异迅速，已出现能克服现有全部抗病基因的菌株，且致病疫霉属于卵菌，无细胞甲壳素和麦角固醇，单独使用杀菌剂防治效果差，难以完全有效地控制该病，且单纯依靠传统农业防治具有局限性[18-20]，因此寻找新的安全的防治方法势在必行。近年来，生物防治已成为研究热点，利用植物源提取物和微生物农药防治马铃薯晚疫病受到了越来越多研究者的关注。已有研究表明知母水提取物、九里香乙醇粗提物对致病疫霉的生长和游动孢子释放有显著的抑制作用，且提取物的抑制作用与浓度呈正相关，EC50值分别为1.91 mg/mL和6.51 mg/mL，地果甲醇提取物浓度为1 mg/mL时抑菌率达90%[21-24]。本研究筛选了5 种蒿属植物提取物对2 株马铃薯晚疫病菌的抑制活性，结果表明5 种提取物在浓度为1 mg/mL 的浓度下均对供试菌株具有一定的抑菌活性，其中牛尾蒿提取物对马铃薯晚疫病病菌pn5502 和pn7604 的抑菌活性均为最高，青蒿提取物次之；进一步对牛尾蒿提取物的抑菌活性成分进行了追踪，发现馏分Fr1具有显著抑菌活性，在浓度为0.5 mg/mL对2 株供试菌株的抑菌率均高达100%，并且呈显著的剂量效应，经不同浓度梯度测定馏分Fr1对pn5502、pn7604 的EC50值分别为7.4733 μg/mL、9.4634 μg/mL 显著高于阳性对照药剂霜脲·锰锌，其对2 株菌的EC50分别为273.8 μg/mL 和169 μg/mL，显微观察发现被馏分Fr1处理后的菌丝会出现明显的畸形，因此有必要进一步阐明其抑菌活性成分，及其作用机制。杨立宾等[25]发现哈茨木霉发酵液乙酸乙酯提取物降低了致病疫霉菌体可溶性蛋白含量，降低菌体保护酶活性，使菌体丙二醛含量升高，提高菌体电导率，降低菌体呼吸速率，致病疫霉系统清除自由基出现障碍、细胞膜被破坏、电解质外露，对致病疫霉有直接抑制作用。林敏等[26]研究发现亚磷酸盐作为新型植物诱抗剂，除直接作用于致病疫霉菌丝的生长和游动孢子的释放外，还可以通过刺激植物体内抗病物质的产生和积累等起到间接防病作用。本研究发现正常生长的致病疫霉菌丝体粗细均匀、表面光滑、分枝较少、发育正常、内含物丰富且均匀分布，而牛尾蒿馏分Fr1处理后病原菌菌丝体出现分枝增多、表面粗糙、内含物聚集等现象，与阳性对照药剂霜脲·锰锌处理的症状类似，表明致病疫霉处于明显的胁迫条件。上述异常症状的出现可能与牛尾蒿馏分Fr1中存在的活性成分破化了菌体的正常代谢，使得菌体细胞内毒性物质大量积累，严重破坏了细胞膜的完整性，导致菌丝出现畸形。牛尾蒿是我国传统的藏药，具有很高的药用价值[27]。牛尾蒿农用研究多为饲喂牲畜、精油化学成分研究、生物多样性研究、土壤重金属修复；目前对牛尾蒿生物活性的筛选和评价大多停留在其精油的杀虫活性[28-31]，而对其化学成分在杀虫、抑菌等生物农药活性方面报道相对较少。本研究发现了牛尾蒿提取物在离体条件下对马铃薯晚疫病菌良好的抑菌活性，丰富了牛尾蒿生物活性的范畴，后续我们可以进一步进行活体实验，评价其在田间防治马铃薯晚疫病的实际防效，阐明具体的活性成分及其作用机制，为进一步开发绿色无公害、环境友好型植物源农药[32]提供理论基础和科学依据。