水杨酸诱导的月季对甜菜夜蛾的抗性及机理研究

唐 敏 程 静 许雁祥 朱国磊 杨发忠

（西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室，西南林业大学，云南 昆明 650233）

植物激素水杨酸（SA）是一种广泛存在于植物体中的小分子酚类物质[1-2]，在植物体中主要通过异分支酸合酶（ICS）途径和苯丙氨酸解氨酶（PAL）途径合成[3]。SA 是植物体内重要的免疫激素，对多种重要代谢过程起到调控作用，包括病原相关分子模式触发的免疫反应（PTI）和效应子触发的免疫反应（ETI），在这些植物先天免疫系统中，SA 发挥了重要作用[4]。在病原物入侵植株时，植物通常启动水杨酸信号转导途径，使植株产生系统获得性抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR），从而减少病原物侵染对植物造成的危害[5]。如月季（Rosa chinensis）受到月季白粉菌（Podosphaera pannosa）的侵染时，植物体内SA含量上升，从而增强对白粉菌入侵的适应性[6]。

与此同时，SA 也可以作为外源诱导物诱导多种植物对多种生物胁迫产生抗性或适应性。已有研究表明，同一植物上的病害和虫害之间存在着寄主植物介导的间接的病虫互作关系，而SA 是这种互作关系的重要物质基础，在这一过程中起着重要作用[7]。内外源SA 均可能诱导植物在产生抗病性的同时增强植物对植食性害虫的抗性。如外源SA 处理能增强番茄（Lycopersicon esculentum）植株对烟粉虱（Bemisia tabaci）的抗性[8]。在SA 的诱导作用下，植株次生代谢产物发生变化，对害虫产生间接防御[9]，可能释放含特异性成分的挥发物，作为天然信息化合物，被昆虫用于识别寄主植物的适合性，间接抵制昆虫的危害[10]。其中，SA 诱导黄瓜（Cucumis sativus）产生具有驱避作用的萜烯类物质，从而对西花蓟马（Frankliniella occidentalis）的取食、产卵产生影响，使黄瓜植株对西花蓟马产生诱导抗性[11]。

但是截至目前，仍不清楚外源水杨酸诱导是否能增强月季植株对甜菜夜蛾的抗性，同样，SA处理月季后是否会诱导月季挥发性成分（VOCs）发生变化也是未知的。因此将采用外源SA 对月季植株进行诱导，研究其对甜菜夜蛾的影响，并通过顶空动态吸附法原位收集月季枝条的挥发物，通过GC−MS 分析明确其组成及含量变化，测试SA 诱导月季新合成的化合物对甜菜夜蛾是否具有生物活性，以期探明SA 诱导月季对甜菜夜蛾产生抗性的化学机理。

1 材料与方法

1.1 材料来源和仪器试剂

1.1.1 植物与昆虫

供试昆虫甜菜夜蛾、供试植物月季幼苗均采自云南省昆明市呈贡区斗南花卉种植基地用于切花月季（艳粉）生产的大棚中。

1.1.2 仪器与试剂

美国Agilent Technologies 公司HP6890GC/5973 MS 气相色谱−质谱（GC−MS）联用仪；吸附剂为Porapak Q（80～100 目，Waters，USA）；正己烷和丙酮均为色谱纯；水杨酸（SA）以及包括正构烷烃在内的所有用于GC−MS 分析和产卵实验的标准品（共40 种）购自百灵威公司，含量≥99%。

1.2 研究方法

1.2.1 月季栽培

将采回的健康无病虫害的中国月季幼苗用基质进行栽培，进行适时浇水、施肥、防病虫害等正常管理，防止白粉菌侵染。培育条件为温度27 ℃、湿度70%、光周期12 h/d，至嫩枝达30 cm左右用于实验中。

1.2.2 甜菜夜蛾饲养

甜菜夜蛾幼虫采回后置于养虫盒内用月季叶片饲养至化蛹，待成虫羽化后置于产卵笼内交配、产卵，笼内放置蘸10%蜂蜜水的棉球补充成虫营养，放入健康月季枝条供其产卵。采集带有即将孵化的卵块的月季叶片，放入铺有湿润滤纸的养虫盒中，并放入部分新鲜月季叶片，待卵孵化后自由取食。每天观察，及时更换中国月季叶片。饲养条件为温度27 ℃、湿度70%、光周期12 h/d。化蛹后转入润湿的土壤中保湿，以防止蛹失水过多而死亡。并严格认真做好整个饲养过程中杀菌消毒的工作，防止甜菜夜蛾幼虫受到核型多角体病毒或颗粒体病毒感染。

1.2.3 产卵测试I

SA 用少量乙醇溶解，并用v（乙醇）∶v（水）为1∶3 的溶剂，稀释至1 mmol/L[12]。选取健康无病虫害的月季植株，用SA 溶液进行叶面喷施，每天1 次，每株每次5 mL；对照组用相应溶剂同法喷施。连续处理6、9、12 d 后，分别采集处理组和对照组枝条，各1 束，每束4 枝，插入有水的烧杯中。将两束枝条对角放入用细铁丝纱网自制的产卵笼中，分开50 cm，中间放置蘸有10%蜂蜜水的棉球，放入飞翔正常、雌雄配对的甜菜夜蛾成虫4 对，让其任意选择在2 种枝条上产卵。实验开始后的第3 天、第5 天、第7 天分别记录产卵量，记录完毕更换同法处理的新鲜枝条，并计算产卵量的每雌均值，重复5 次。用总产卵量计算抑制指数（II）：

式中：OCK表示对照枝条上的产卵量，OT表示SA 处理后的枝条上的产卵量。

1.2.4 挥发性成分捕集

参照Giusto 等[13]的方法，采用动态顶空吸附（DHSA）法，不将枝条剪下，在活体月季植株上对挥发性成分（VOCs）进行原位捕集。将1 枝经SA 处理6 d 后的枝条封入PET 袋（耐受温度>200 ℃）中，从下部通入气流。空气流先经过活性炭、去离子水，再经过装有吸附剂Porapak Q的玻璃吸附管进入袋中，并从PET 袋上部抽出、经过第2 个Porapak Q 吸附管。进出口气流量分别为600 mL/min 和500 mL/min，以保证外界气体不进入PET 袋。收集时间8 h，完成后将第2 支吸附管取下，用5 mL 正己烷将月季释放的VOCs混合物从吸附剂上洗脱下来，−80 ℃保存备用。共从5 枝枝条上收集，合并捕集物，实验前N2顶吹浓缩，用于GC−MS 分析和产卵实验。SA 处理9、12 d 后的枝条 以及对照植株的VOCs 同 法收集。

1.2.5 产卵测试II

将1.2.4 中分别从SA 处理过的植株和对照植株收集的VOCs 用v（乙醇）∶v（水）为1∶3 的溶剂分别稀释至5 mL。选取健康无病虫害、未经任何处理的月季枝条2 束，分别用2 种VOCs 稀释液喷施，并按照1.2.3 中的方法进行产卵实验。

1.2.6 GC−MS 分析

采用GC−MS 法分析两类月季VOCs 混合物中各物质的组成和含量，并采用相同方法进行背景扣除（不放入月季枝条）。GC 条件：HP−5 MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温：起始温度40 ℃，程序升温3 ℃/min 至80 ℃，再程序升温5 ℃/min 至260 ℃；气流量为1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；柱前压100 kPa；进样量2.0 μL；不分流，载气为高纯氦气。MS 条件：电离方式EI；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量范围29～500 amu。

1.2.7 单体活性测试

根据GC−MS 结果选择需要进行活性测试的化合物，这类化合物在正常月季植株中不会合成，只有在SA 的诱导作用下才会合成出来的新化合物，可能在月季抗虫过程中起到重要作用。将所选化合物配制成0.1、0.5、2.5、12.5 mg/mL溶液（v（乙醇）∶v（水）为1∶3 的溶剂），按1.2.5 的方法喷施到2 束月季枝条上同法进行产卵实验，计算抑制指数II。

1.2.8 数据分析

根据GC−MS 检测结果，对有标准品的40 种化合物采用外标法定量；对未能购买到标准品的4 种化合物，选择保留时间与之最相近的正构烷烃作为外标物进行定量。结果用每小时内每克新鲜嫩枝释放的挥发物的质量（ng/(g·h)）表示。定性鉴定方法：1）通过GC−MS 检测所得信息和wiley7n.l 标准谱库进行比较；2）根据正构烷烃计算出目标化合物的科瓦茨指数并与文献比较；3）与NIST 数据库在相同分析条件下的数据进行比较；4）与标准品进行对照。

产卵量差异统计分析使用SPSS 21.0（IBM−SPSS，USA）中的单因素方差分析（ANOVA）进行（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 水杨酸诱导对甜菜夜蛾产卵行为的影响

直接采用水杨酸（SA）处理过的月季枝条及对照枝条进行甜菜夜蛾产卵行为生物测试，所得结果如图1 所示，图1 中A、B、C 分别为SA 处理6、9、12 d 的枝条。从该结果可以看出，SA诱导了月季植株对甜菜夜蛾产生抗性，使雌蛾在SA 处理后的植株上产卵量明显减少。从总产卵量来看，处理6、9、12 d 后，产卵量与对照相比均显著下降，差异达到显著水平（P<0.05）。根据总产卵量计算，处理6、9、12 d 对应的抑制指数II分别为35.4%、38.9%、47.5%，随着处理时间延长，II增加，抑制作用存在明显的时间效应，亦即，SA 处理对甜菜夜蛾产卵行为的抑制作用增强。从产卵开始后的各时间段来看，除了图1a 中产卵时间为7 d 时的产卵量外，其他各时段的产卵量与对照相比均存在显著性差异（包括图1a−c）。

图1 SA 诱导月季植株对甜菜夜蛾产卵行为的影响Fig.1 Effect of induction of R.chinensis plants by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

与此同时，先将SA 处理的植株和对照植株顶空VOCs 提取出来，再将VOCs 混合物配成溶液喷施两束相同的未经处理的健康月季枝条，让甜菜夜蛾自由选择在喷施后的2 种月季枝条上产卵，测试SA 处理的月季VOCs 对产卵行为的影响，结果如图2 所示。

图2 SA 诱导的月季顶空挥发性成分混合物对甜菜夜蛾产卵行为的影响Fig.2 Effect of the mixtures of headspace R.chinensis volatiles induced by SA on ovipositional behaviour of S.exigua

从图2 可以看出，在喷施了SA 处理后提取的挥发物的枝条上甜菜夜蛾的产卵量与对照相比显著减少。SA 处理后月季挥发物对甜菜夜蛾产卵行为具有明显的抑制作用，随着处理时间延长，抑制作用增强，与对照相比差异均达到显著水平（P<0.05）。SA 处理6、9、12 d 后挥发物对产卵行为的抑制指数II分别为23.9%、25.4%、36.2%（根据总产卵量计算），也表现出明显的时间效应。

综合图1 和图2 的结果来看，SA 处理诱导月季对甜菜夜蛾产卵行为产生了明显抑制作用，主要原因是SA 诱导了月季VOCs 变化，这种变化能被甜菜夜蛾成虫明显地识别出来，从而避免在SA 处理过的月季上产卵。结果表明SA 诱导的月季VOCs 变化在甜菜夜蛾产卵地选择过程中起到重要作用。

2.2 GC−MS 分析

GC−MS 分析结果（表1）表明，SA 处理诱导了月季挥发性成分（VOCs）显著变化。从化合物种类看，未经处理的月季顶空VOCs 主要包含萜类（52.43%）、醛类（25.38%）、芳香族类（17.12%）、烃类（3.73%）；SA 处理6 d 后主要包含萜类（28.85%）、芳香族类（24.11%）、醛类（22.73%）、酯类（8.42%）；9 d 后主要包含萜类（42.75%）、芳香族类（15.70%）、醛类（14.96%）、酯类（9.10%）；12 d 后主要包含萜类（32.83%）、醇类（15.38%）、芳香族类（13.80%）、羧酸类（11.41%）。其中，含量变化最大的是醇类，SA 处理12 d 后与对照相比增加了5.85 倍，从对照的2.63%增加到15.38%；而萜类则从对照的52.43% 下降到32.83%，仅为对照的2/3 左右。

表1 SA 诱导的月季植株挥发性成分变化Table 1 Change of SA−induced volatiles released by R.chinensis plants

从单体化合物看，SA 诱导12 d 后，有10 种单体消失（未检出）；21 种单体含量下降，其中，β−石竹烯、(E)−2−己烯−1−醇、β−榄香烯、芳樟醇与对照相比下降程度最大，分别下降了89.68%、76.25%、72.08%、65.07%；5 种化合物含量上升，其中，十六烷上升了118.77%、α−松油醇上升了92.71%；新增单体化合物8 种（在CK 中未检出），其中，十四烷醇从CK 中的0.00%增加至12.94%，增幅最大。

简言之，SA 诱导的月季植株顶空挥发物最明显的变化是β−石竹烯释放量减少，以及诱导植株新合成了十四烷醇。

另外，在8 种SA 诱导新增的化合物中，十四烷醇、2−乙基己酸、棕榈酸甲酯和乙酸十六酯这4 种化合物，处理12 d 后的含量分别为12.94%、11.41%、6.02%、5.32%，在所有新增化合物中含量最大。4 种化合物的含量均随着SA 处理时间的延长而逐渐增加，表现出明显的时间效应（如图3 所示）。

图3 SA 诱导4 种月季单体挥发物含量变化的时间效应Fig.3 Temporal effect of the changes in contents of 4 SA−induced monomer volatile in R.chinensis

2.3 单体化合物对甜菜夜蛾产卵行为的影响

将SA 诱导月季新合成的4 种单体化合物（十四烷醇、2−乙基己酸、棕榈酸甲酯和乙酸十六酯）配置成溶液，喷施于健康枝条上测试它们对甜菜夜蛾产卵行为的影响，结果如图4 所示。可以看出，随着4 种单体的浓度增加，抑制指数II增加，表明它们对产卵的抑制作用增强，显示出明显的浓度效应，表明它们都有较强的活性。其中，十四烷醇的活性最强，在较低浓度下就对产卵产生了较强的活性，当浓度为0.5 mg/mL时，抑制指数就已超过35%。其他3 种化合物则在施用浓度大于2.5 mg/mL 时，对甜菜夜蛾的产卵行为产生明显的抑制作用。

图4 SA 诱导的4 种单体活性成分对甜菜夜蛾产卵行为的影响Fig.4 Effect of 4 SA−induced active mono-chemicals on ovipositional behaviour of S.exigua

3 结论与讨论

用外源水杨酸（SA）处理月季植株可使植株产生对甜菜夜蛾的诱导抗性，从化学机理角度看，主要与月季挥发性成分变化有关。结果表明，SA 处理能使甜菜夜蛾在植株上的产卵量显著减少，随着处理时间延长，对产卵的抑制作用也增强；在喷施了从处理植株上提取的挥发性成分混合物的枝条上，产卵量显著减少；处理6、9、12 d 后，抑制指数分别为23.9%、25.4%、36.2%。据此，从化学机理角度看，挥发性成分变化是SA 诱导抗性的物质基础。

通常认为，植物体内SA 信号转导途径与植物抗病性有关[2]。但是近年来，也有研究表明SA处理增强了植株的抗虫性[8]。SA 处理能够诱导植物次生代谢产物发生变化，从而间接地对昆虫的危害产生抗性。这其中，植物挥发性成分（VOCs）起到了重要作用[8]。已有研究表明，白粉菌侵染月季能够诱导植株对甜菜夜蛾产生抗性，原因同样与VOCs 有关，与SA 诱导的抗性十分类似。白粉菌诱导了月季VOCs 变化，诱导产生的VOCs混合物对甜菜夜蛾有十分明显的驱避作用[14]。研究结果进一步表明，在白粉菌−月季−甜菜夜蛾组成的三元系统中，SA 途径在寄主植物介导的间接的病虫互作过程中起到了重要作用。

GC−MS 结果表明，SA 处理诱导了月季VOCs发生了显著变化，既有物质种类的变化，也有含量的变化。也有研究表明还可能仅仅是2 种化学成分的比例发生变化[15]。这些化学信息常常被正在寻找产卵地的昆虫做为天然信息化合物，用于识别寄主植物适合性，从而增加后代的成活率（即“妈妈知道理论”）[16-17]。从结果来看，甜菜夜蛾能够明显地识别出SA处理过的月季植株，宁愿在未处理过的植株上产卵，而避免SA 处理过的月季植株。原因包括，一是具有引诱活性的成分含量下降，如SA 诱导了芳樟醇和β−榄香烯含量下降；二是具有驱避活性的单体化合物在SA 的诱导作用下被月季合成出来，甜菜夜蛾能够准确识别这些天然信息化合物，并避免在释放这些化合物的植株上产卵。其中，SA 诱导月季新合成的具有驱避活性的化合物有4 种，包括2−乙基己酸、十四烷醇、棕榈酸甲酯、乙酸十六酯，在未处理的月季植株中正常情况下不会合成，但在SA 的诱导作用下能够合成，具有明显的时间效应，并且随着处理时间的延长，含量增加，这类化合物最有可能被甜菜夜蛾做为信息化合物用于识别寄主植物是否适合繁衍生息；结果正好表明它们对甜菜夜蛾产卵行为有明显的驱避作用。并且，产卵生物测试结果也表明，这4 种化合物对甜菜夜蛾产卵行为的抑制作用表现出明显的剂量效应。而在这4 种化合物中，驱避活性最强的是十四烷醇。白粉菌侵染月季也诱导了十四烷醇含量显著上升[6]，只是之前的研究未证实其对甜菜夜蛾有驱避活性。所得结果不仅阐明了SA 诱导月季对甜菜夜蛾产生抗性的化学机理，也进一步表明，白粉菌侵染月季诱导植株对甜菜夜蛾产生抗性，与SA 信号转导途径有关。

本研究结果还表明，SA 可以用于月季上的甜菜夜蛾的防治。同时，SA 诱导的月季挥发性成分混合物以及十四烷醇等单体化合物也可用于该虫防治。这些物质来源于天然，在自然界有着完整的降解途径，可用于植物保护，可实现可持续发展的绿色无公害防治。