1 株产色素毛壳菌的分离鉴定及其生物学特性

李 亚 唐绍荣 程波普 杨 斌 赵 宁,

（1.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明，650233；2.弥渡县林业有害生物防治检疫局，云南 大理，675600；3.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明，650233）

色素在人们的日常生活中及各类化工领域都有着广泛的应用，随着人民生活水平的不断提高，人们对于色素质量的要求也越来越高[1]。由于生态文明型社会发展的需求，天然色素进入了一个快速发展的时代。天然色素来源于天然资源，分为植物色素、动物色素、微生物色素和矿物质色素[2-3]。天然色素的来源赋予色素较高的安全性，受到了人们的青睐。但植物色素、动物色素和矿物质色素相对于微生物色素因为资源的有限性，发展受到了一定的限制。而微生物色素因其性质稳定，生产不受时间、空间限制等特点更受青睐[4-5]。

现有的研究表明，微生物色素不仅在食品中有着广泛应用，在医药、化妆品、染料等方面也有着很大的发展前景[6-8]。王金字等[9]介绍了红曲色素在食品中的应用；徐春明等[10]介绍了醌类色素有抗癌、抗菌的作用；徐银莉等[11]使用紫红丝膜菌色素对羊毛织物进行染色，发现该色素有较好的染色效果。目前报道的真菌色素已有600 多种[12]，而对于已开发的微生物色素，如黑色素、红曲色素、蓝色素、黄色素等[13-14]都有了一定的研究，其中对于红曲色素的应用和研究最为广泛[15-17]。天然的红曲色素是一种稳定性好，安全性高的色素，不仅能用于传统的食品染色，还具有抑制胆固醇合成、降血压、预防老年痴呆等多种保健功能[18-19]。天然红色素有重要的应用价值，但是目前用于生产红色素的微生物菌种非常有限，据报道主要为红曲霉属（Monascus）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）等[1-3,20-21]，因此从自然界中筛选高产红色素的优良菌种具有重要的意义。

毛壳菌（Chaetomiumspp.）属于子囊菌门（Ascomycota）、核菌纲（Pyrenomycetes）、粪壳菌目（Sordariales）、毛壳菌科（Chaetomiaceae）[22]，其分布广泛，植物残体、土壤、动物粪便、木材等类群中都有存在[23]。现有研究表明，毛壳菌主要作为生防菌在植物病害中使用，如球毛壳菌（C.globosum）、角毛壳菌（C.cupreum）、近缘毛壳菌（C.subaffine）等都能产生具有抗菌活性的物质，在病原真菌引起的多种植物病害中均有应用[24-27]；但目前对毛壳菌产色素的研究报道较少。中国是核桃生产大国，截至2018 年底种植面积超过795.5 亿m2[28]，极易从核桃枝干中获取毛壳菌。本研究从核桃枝干中分离到1 株产红色色素的菌株，并通过形态观察和分子生物的方法确定该毛壳菌的分类地位，对其生物学特性及产色素规律进行研究，为进一步研究和应用该菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

从云南省大理白族自治州云龙县（海拔2044 m，25°44′47″N，99°34′20″E）采取的核桃枝干上分离得到。

1.2 菌株的分离纯化

采用组织分离法从核桃枝干中进行菌株的分离，将核桃枝干用自来水清洗干净，取大小为5 mm×5 mm 的组织块，用75% 的乙醇浸泡30 s，0.1%的升汞消毒30 s，无菌水清洗3 次，将消毒后的组织块放置于PDA 培养基上，25 ℃培养3 d，待长出菌落后，挑取菌落进一步培养，于PDA 培养基上获得编号为YLHT−2A 的菌株。

1.3 菌株的形态观察

将菌株YLHT−2A 接种于PDA 培养基上，放置于25 ℃环境下培养，每天观察记录菌落的生长特征。在菌落的不同生长时期取菌丝放置于载玻片上，载玻片事先滴1 滴蒸馏水，覆盖上盖玻片，放置于光学显微镜下观察菌丝、孢子等显微结构。

1.4 菌株的分子生物学鉴定

用真菌基因组试剂盒提取菌株DNA，以引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC ）进 行PCR 扩增[29]。PCR 反应体系（50 μL）为：2×Buffer 25 μL，DNA 模板1 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反应条件：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，3 min；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30 个循环，72 ℃延伸10 min。将扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。将测定的DNA 序列结果在NCBI 中进行BLAST 比对，选择同源性较高的序列在MEGA 7.0 中以Neighbor-Joining（NJ）法构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.5 生物学特性研究

1.5.1 不同培养基对菌株生长及色素的影响

使用灭菌打孔器打取直径大小一致的菌块接种在PDA、SDAY、LB、查氏和淀粉5 种不同的固体培养基上，每种处理做5 个重复，将其放置于25 ℃的恒温培养箱中，每天观察并在5、7、10 d 时以十字交叉法测量不同培养基上菌落的大小，并在培养至第10 天时以蒸馏水为溶剂，温度60 ℃，功率100 W，时间20 min 的条件，采用超声提取红色素并在510 nm 处检测吸光值[30-31]，综合菌落直径和色素吸光值指标，筛选出最佳培养基，为后续研究提供基础条件。

1.5.2 温度对菌株生长及产色素的影响

以PDA 培养基为基础培养基，将菌株YLHT−2A 打取相同大小的菌块放置在5、10、15、20、25、30、35 ℃的条件下培养，每种处理做5 个重复，每天观察并以十字交叉法测量不同培养温度下菌落的大小，并在培养至第10 天时采用超声粗提取其所产色素，色素含量测定方法参照1.5.1，综合菌落直径和色素吸光值指标，筛选出最佳培养温度。

1.5.3 pH 对菌株生长及产色素的影响

将PDA 培养基灭菌后使用1 mol/L 的盐酸和1 mol/L 的氢氧化钠将pH 调节为4、5、6、7、8、9、10 共7 个梯度，将菌块接种于不同处理的培养基上，每种处理做5 个重复，每天观察并以十字交叉法测量不同培养基上菌落的大小，并在培养至第10 天时采用超声粗提取其所产色素，色素含量测定方法参照1.5.1，综合菌落直径和色素吸光值指标，筛选出最适合菌株生长的pH 条件。

1.5.4 光照对菌株生长及产色素的影响

以PDA 培养基为基础培养基，将菌株放置在24 h 黑暗，24 h 光照，12 h 光暗交替的培养环境中，每天观察并以十字交叉法测量不同培养基上菌落的大小，并在培养至第10 天时采用超声粗提取其所产色素，色素含量测定方法参照1.5.1，综合菌落直径和色素吸光值指标，筛选出最佳培养光照条件。

1.6 数据处理

使用SPSS 22.0 软件，采用LSD 事后多重比较方法对各处理组数据进行差异显著性分析[32]。

2 结果与分析

2.1 菌株的菌落特征与形态鉴定

从核桃枝干中经组织分离法筛选得到1 株高产红色色素的菌株YLHT−2A，其菌落特征及有性产孢结构见图1。由图1 可看出，该菌株在生长的过程中会有红色物质产生使培养基着色。菌落绒状，浅黄色，有红色物质溢出，培养基平板变红色，后期出现明显的浅黄色和红白相间的环纹，边缘菌落呈浅绿色，培养基平板红色加深，菌落背面红色。

图1 菌株YLHT−2A 的菌落特征及有性产孢结构Fig.1 Colony characteristics and sporulation structure of strain YLHT−2A

将菌株YLHT−2A 的菌丝、子囊、子囊果置于显微镜下观察看出，子囊果表生，反射光下呈灰绿色，卵形或近球形，着生有附属丝，大小为193～203 μm×91～121.5 μm；子囊果壁细胞褐色，易破碎，果壁细胞多为不规则的多边形，呈网格状排列；子囊棍棒状，具柄，内有8 个子囊孢子，子囊壁易消解，大小为22～30 μm×10～12.5 μm；子囊孢子两侧不对称呈纺锤形或舟形，初期颜色较浅，成熟后呈灰褐色，大小为8.5～11.5 μm×4.5～5.5 μm。

2.2 菌株的分子鉴定

测序得到菌株YLHT−2A 的ITS 序列长度为579 bp，将测序结果 在NCBI 中进行BLAST 比对，发现菌株YLHT−2A 与C.aureum同源性高达99.46%。选取同源性高的序列在MEGA 7.0 软件中序列比对后，根据Kimura 2−parameter 法计算遗传距离，以NJ 法Bootstrap 1000 次后构建系统发育树。根据图2 构建的ITS 序列进化树可看出，菌株YLHT−2A 与3 株C.aureum菌株在同一分支，Bootstrap 检验值为99，说明发育树表示的菌株YLHT−2A 与3 株C.aureum之间的进化关系可信。结合形态学结果及ITS 基因序列的分析结果，可将菌株YLHT−2A 鉴定为金色毛壳C.aureum[33-35]。将菌株YLHT−2A 的核酸序列提交到GenBank，得到菌株序列号为MT003228。

2.3 生物学特性

2.3.1 培养基种类对YLHT−2A 菌株生长及产色素的影响

C.aureumYLHT−2A 菌丝在不同培养基中生长及产色素具有差异性（图3）。结果表明，菌丝在5 种培养基上均能生长，培养至第10 天时，PDA 培养基上的菌落直径达到4.72 cm，而淀粉培养基上的菌落直径为5.15 cm，与其他3 种培养基上的生长情况存在显著差异（P<0.05）。而在培养至第10 天时检测不同培养基中产生的色素含量发现，PDA 培养基最适合色素分泌，与另外4 种培养基的色素产量差异显著（P<0.05）。

图3 不同培养基对C.aureum 生长及产色素的影响Fig.3 Effects of different media on C.aureum growth and pigment production

2.3.2 温度对YLHT−2A 菌株生长及产色素的影响

温度对C.aureumYLHT−2A 菌丝的生长及产色素具有差异性（图4）。结果显示，菌丝在低于15 ℃的条件下不能生长，而在20～35 ℃的范围内均能生长，并且30 ℃是最适宜C.aureum生长的，在培养至第10 天时，其菌落直径可达6.48 cm，与其他培养温度条件存在显著差异（P<0.05）。

在培养至第10 天时，提取不同温度下培养菌株所产的色素发现，温度低于15 ℃时菌株不产生色素，在30 ℃时菌株所产的色素含量最高，且其色素含量与25 ℃和35 ℃条件下存在显著差异（P<0.05）。由图4 可看出，在不同的培养温度下，C.aureum的菌落生长速度与色素产生量变化趋势一致，30 ℃是最适合C.aureum生长的温度。

图4 温度对C.aureum 生长及产色素的影响Fig.4 Effects of temperature on C.aureum growth and pigment production

2.3.3 pH 对YLHT−2A 菌株生长及产色素的影响

图5 显示pH 影响菌丝的生长及产色素情况。C.aureumYLHT−2A 在pH 为4～10 的条件下均能生长，但在中碱性的条件下生长状况更好，且在pH>6 的条件下菌落生长情况差异不显著（P>0.05）。

图5 pH 对C.aureum 生长及产色素的影响Fig.5 Effects of pH on C.aureum growth and pigment production

在培养至第10 天时，提取不同pH 下培养菌株所产的色素发现，在酸性条件下，C.aureum产生的色素较少，pH 为4 时，其所产生的色素圈颜色较浅。而随着pH 的增大，色素的含量越高，pH 为10 时产生的色素含量最大（P<0.05）。而在pH 等于6、7、8 的条件下，其色素含量无明显差异。

2.3.4 光照对YLHT−2A 菌株生长及产色素的影响

从图6 中可以看出，不同的光照条件对C.aureum的菌落生长情况无显著差异，在不同光照条件下菌株均可以正常生长。

图6 光照对C.aureum 生长及产色素的影响Fig.6 Effects of light on C.aureum growth and pigment production

在培养至第10 天时，提取不同光照条件下培养菌株所产的色素发现，其所产生的色素在12 h光暗交替的条件与全黑暗和全光照的条件下培养的含量差异不显著，全黑暗与全光照培养条件下的色素含量存在显著差异（P<0.05），全黑暗条件下所培养的色素含量显著高于全光照条件下培养所产生的。

3 结论与讨论

本研究从核桃枝干中分离到1 株产红色素的菌株YLHT−2A，结合形态学和分子生物学的方法将该菌株鉴定为金色毛壳C.aureum，其最佳培养条件为PDA 培养基，培养温度30 ℃、全黑暗及pH 为10。

通过对C.aureum在不同环境下的培养观察，发现不同的培养条件下，菌株的生长速率及色素OD510存在差别。筛选不同的生长培养基发现，C.aureum在5 种培养基上均能生长，但菌落形态存在差异，综合菌落生长和色素OD510的指标，判断PDA 培养基是最佳培养基；筛选最佳培养温度，发现菌株在20～35 ℃的条件下均能生长，低于15 ℃的条件不适合菌落和色素的培养，其中在30 ℃时最适合C.aureum生长，此时菌落生长速度与色素产生的变化规律一致；筛选最佳pH，发现C.aureum在pH 为4～10 的范围内均能生长，对酸碱度较不敏感，但碱性条件下的生长状况要优于酸性条件；而C.aureum的产色素情况对酸碱度较为敏感，在pH 为4 时，所产的色素较少，随着碱性增强，色素OD510增大。综合考虑，碱性条件pH 为10 时更适合C.aureum生长；筛选最佳培养光照条件发现，C.aureum菌株生长对光照条件的需求不严格，在24 h全光照、24 h 全黑暗和12 h 光暗交替的条件下均能生长，且差异不显著，但C.aureum所产的色素在24 h 全黑暗的条件下OD510更高。

金色毛壳菌C.aureum是一种非常重要的资源真菌，通常被作为生防菌使用[36]。早在1975年[37]，就有人对其进行了研究。Wang 等[38]探究发现C.aureumMF−91 对稻瘟病菌和纹枯病菌有一定的抑制作用；Kabbaj 等[39]对C.aureum产生的活性物质进行了研究，目前国内外对C.aureum的研究主要集中在其生防作用上。李静等[33]对多种毛壳菌的生长温度特性进行探究，发现菌株生长温度可以作为毛壳属物种鉴定的一个指标。而对于C.aureum可以分泌色素的情况，谭悠久[34]在其分类鉴定得到的菌株中发现C.aureum可以产生无色分泌物；张丰[35]鉴定得到的C.aureum可以产生红色分泌物使PDA 培养基变红，说明不同的菌株在生物学特性方面会存在一定的差异。但对其产色素的研究尚未见相关报道。天然微生物色素在色素市场上具有很强的竞争力，开发新的可产色素的菌株对于色素市场有重要的经济价值。据统计，目前主要的微生物色素有红、橙、黄、绿、青、蓝、紫、褐色和黑色等，其中天然红色素被广泛的应用到食品和医疗行业，产红色素的菌株以红曲霉研究最多[40]。目前市场上真菌所产的红色素，如张立强等[41]研究的黑曲霉菌（Aspergillus niger）所产的红色素在pH 为5～9 的条件下保持稳定；刘维等[42]对一株铁皮石斛内生真菌所产的红色素进行研究，发现该菌所产色素对自然光和温度较为稳定，而在pH>7的环境下稳定性更好，本研究中的C.aureum在pH 为4～10，以及不同光照条件下均能继续分泌红色素，说明菌株YHLT−2A 所产的色素有着极好的稳定性，对酸碱的耐受性较好，有进一步开发利用的潜力。本研究从核桃中分离得到了1 株产红色素的毛壳菌，拓宽了产红色素菌种资源的来源。对该菌株进行了形态和分子描述，并对该菌株的基本培养特性与产色素之间的关系进行了探究，为毛壳菌属菌种资源的分类鉴定及开发利用提供了相关理论依据。