精神分裂症患者的差异代谢物筛选方法研究及应用*

刘 娟 刘 壮 王 菲，3△

【提 要】 目的 应用单变量分析联合正交偏最小二乘判别分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)探索精神分裂症患者与健康对照者的代谢谱差异。方法 收集118例精神分裂症患者与123例健康对照者的血浆并进行非靶向代谢组学检测，运用非参数检验联合OPLS-DA模式识别方法筛选差异代谢物，然后进行通路分析探索紊乱的代谢通路。结果 基于非靶向代谢组学技术检测到669个代谢物，联合非参数检验(Wilcox-Mann-Whitney test)与OPLS-DA方法筛选出52个差异代谢物(P<0.05，VIP>1.5)，主要涉及糖代谢、氨基酸代谢和脂代谢。通路分析结果显示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢通路与三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环失调相关(FDR<0.05)。结论 应用单变量分析联合多元模式识别技术进行精神分裂症的代谢组学数据分析，能够识别与疾病分子机制相关的差异代谢物，有助于了解疾病的本质并为精神分裂症的诊断、干预及治疗提供依据。

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是一种严重的精神障碍，全球患病率约1%，通常伴随认知、情感体验、社交能力的损害，多发病于青壮年，病情反复，给患者、家庭和社会造成了沉重的经济负担[1-2]。精神分裂症的病因复杂，目前主要的假说有神经递质紊乱假说和神经发育障碍假说，但其确切的分子机制迄今不明[3]。神经细胞代谢的紊乱可能导致神经发育和脑结构的异常，即使是微小的代谢率改变也会影响中枢神经递质如多巴胺、乙酰胆碱、Y- 氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,GABA)的释放和合成[4-5]。研究发现，精神分裂症患者前额叶皮质葡萄糖代谢率降低，这可能与其受损的认知功能密切相关[6]。越来越多的证据提示，精神分裂症的发病不仅仅是大脑结构功能的改变，更可能是一种全身系统性疾病，因此从系统水平描述机体整体改变对理解复杂疾病的病理生理变化尤为重要[7-8]，同时也为精神障碍的诊断、预防和治疗提供了新的思路。

近年来，随着代谢组学逐渐应用于精神疾病的研究，并发现精神分裂症与广泛的代谢紊乱密切相关，如能量代谢相关代谢通路、抗氧化系统相关代谢通路、神经递质代谢、氨基酸(如谷氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，组氨酸，牛磺酸，脯氨酸)代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢[9-12]等。

精神疾病的代谢组学分析产生信息含量丰富的高维小样本数据，传统的单变量分析方法无法从海量的代谢谱信息中发现代表组间差异的稳定标志物，这是目前代谢组学发展过程中所面临的一个重要挑战[13-15]。正交偏最小二乘判别分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)是一种新型的多元统计数据分析方法，其最大特点是可以去除自变量中与分类变量无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，模型变得简单和易于解释，判别效果更加明显。利用OPLS-DA方法来分析代谢组学数据，得到对分类有较大贡献的差异性物质，从而有助于挖掘疾病代谢模式变化的关键信息[16-18]。

本研究基于超高效液相色谱质谱联用技术(UHPLC-MS)，获取精神分裂症患者与健康对照组血浆样本的非靶向代谢谱信息，联合单变量统计分析与多元模式识别方法鉴别患者组的差异代谢物，进而发现其紊乱的代谢通路，探索精神分裂症代谢谱模式的变化，从系统水平对精神分裂症患者的分子机制进行研究，以期为临床诊断、干预和治疗提供参考。

资料与方法

1.研究对象

患者组由中国医科大学附属第一医院门诊收集的118例精神分裂症患者组成。纳入标准：18岁以上患者符合精神障碍诊断与统计手册(第四版)(diagnostic and statistical manual of mental disorders-IV version，DSM-IV)轴I精神分裂症诊断标准；18岁以下患者符合精神障碍调查筛查表及半定式诊断检查(the schedule for affective disorders schizophrenia for school-age children-present and lifetime version,K-SADS-PL)精神分裂症诊断标准；年龄11～55岁。健康对照组通过社会招募纳入与患者组性别、年龄、身体质量指数(body mass index，BMI)相匹配的健康人，共123例。纳入标准：无精神疾病障碍的诊断史及家族史；11～55岁。所有诊断会谈均在中国医科大学附属第一医院精神医学科完成，由2名经培训的精神科专业人员独立评估，使用简明精神病评估量表(brief psychiatric rating scale，BPRS)评估精神症状的严重程度。

全部受试排除标准：(1)神经系统或其他精神疾病障碍诊断；(2)重大躯体疾病史；(3)药物、酒精滥用或依赖史；(4)合并内分泌系统疾病如糖尿病、高血压、高脂血症；(5)怀孕或哺乳期妇女。

本研究获得中国医科大学伦理委员会批准，且所有受试者在入组前被详细告知研究目的、方法和风险，均自愿参加并签署知情同意书。

2.非靶向代谢组学分析

采集所有参与者的外周血样本，取肘静脉血5ml于EDTA抗凝管中，血液样本于2000g离心10min，分离出血浆样品置于-80℃冰箱保存。在代谢组学分析前先进行样品预处理，将血浆样本取出，于4℃解冻，加入代谢组提取液以沉淀蛋白，涡旋，离心，复溶后干燥保存，直至检测。血浆代谢组学信息在Ultimate 3000超高效液相色谱与Q Exactive Orbitrap质谱仪(UHPLC-HRMS)(Thermo Scientific，San Jose，USA)串联仪器上采集。实验测定过程中加入质量控制(QC)样本的测定，每30个样本加入一个QC样本，以确定样品数据的可靠性和可重复性。数据预处理通过Compund Discoverer version 2.1和TraceFinder software version 4.1(Thermo Scientific，USA)软件完成，包括峰对齐、峰检测参数设定、峰面积提取和数据归一化。统计分析通过SPSS 25.0和SIMCA-P 14.1完成。

3.统计分析与生信分析

采用单变量与多元模式识别技术结合的方法筛选差异代谢物，其中单变量分析根据数据的正态分布情况选择独立样本t检验或者非参数检验(Wilcox-Mann-Whitney test)，采用FDR方法进行校正，P<0.05认为差异有统计学意义；多元模式识别技术采用正交偏最小二乘判别分析区分组间代谢谱差异，通过

OPLS-DA建模获得变量重要性评分(variable importance in projection，VIP)评价模型中变量对类别区分的贡献程度。以P<0.05且VIP>1.5的变量作为差异代谢物，并通过MetaboAnalyst 4.0(http：//www.metaboanalyst.ca/)在线平台对差异代谢物进行通路分析，通路分析FDR<0.05被识别为显著改变的代谢通路。

结 果

1.所有研究对象的基本特征

两组受试对象在性别、年龄、身体质量指数方面差异无统计学意义(p>0.05)，在简明精神病评定量表得分的差异有统计学意义。见表1。

表1 受试对象的人口学资料

2.筛选差异代谢物

经过UHPLC-MS分析，共获得669个代谢物，其中正离子模式(ESI+)下检测到473个，负离子模式(ESI-)下检测到196个。在QC和内标物校准代谢物的响应后，90.8%的代谢物在正模式下相对标准偏差RSD<20%，95.4%的代谢物在负离子模式下的RSD<20%，表明本次非靶向代谢组学分析表现出极好的稳定性与可重复性。

如图1所示，数据不服从正态分布，故联合非参数检验(Wilcox-Mann-Whitney test)与OPLS-DA方法进行差异代谢物的筛选，发现52个代谢物(P<0.05，VIP>1.5)在患者组中改变，包括糖代谢的中间代谢产物的水平降低，如葡萄糖/果糖，甘油酸，柠檬酸/异柠檬酸，延胡索酸和苹果酸；氨基酸代谢的中间代谢产物的水平降低，如酰基化的苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸，天冬酰胺；不饱和脂肪酸代谢相关的代谢物的升高，如棕榈油酸和油酸；甾体代谢物水平的降低以及磷脂代谢物的改变。

图1 精神分裂症患者组与健康对照组之间差异代谢物的类别

3.生信分析

如图2所示，进一步的通路分析结果显示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢通路与三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环失调相关(FDR<0.05)。

图2 通路分析结果

讨 论

本研究对精神分裂症患者与健康对照者进行血浆代谢谱信息采集，采用单变量分析联合多元模式识别方法进行差异代谢物的筛选，发现患者组存在广泛的糖代谢和氨基酸代谢相关代谢物水平的降低，不饱和脂肪酸水平的升高，甾体代谢物的降低，以及膜磷脂代谢的紊乱。患者组上述改变的代谢谱是围绕以三羧酸循环为核心的能量代谢紊乱展开的。

在本研究中，患者组TCA循环中的柠檬酸/异柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸明显低于健康对照组(图3)，表明精神分裂症患者存在TCA循环代谢率的降低。先前的研究发现支持这一结果，Liu和Cai等人发现精神分裂症患者存在延胡索酸和柠檬酸水平的改变[19-20]；Bubber等人针对首次发作精神分裂症患者的尸检研究发现其大脑中TCA循环的一系列酶水平显著改变[21]。综上所述，TCA循环的改变可能对机体与大脑代谢产生深刻的影响并导致精神分裂症的发病。

近年来，关于精神分裂症的发病机制，有研究提出线粒体功能与能量代谢障碍假说[22-23]。能量代谢不仅包含糖代谢，还涉及到大部分脂类与氨基酸的合成与氧化分解。根据本研究结果，精神分裂症患者表现出葡萄糖/果糖和氨基酸代谢的代谢物水平降低，这与之前的研究发现一致[24-25]。葡萄糖是能量的主要来源，先前的多个研究均发现精神分裂症患者尸检脑组织、脑脊液和外周血中糖代谢相关的代谢物及酶水平等显著降低，提示糖代谢的降低与精神分裂症的认知功能、语言交流等症状密切相关[26-29]。其中，色氨酸与神经递质5-HT的合成与代谢有关，而GABA是一种抑制性神经递质，这些氨基酸的降低表明精神分裂症存在神经递质代谢的紊乱[30]。此前已有研究报道，精神分裂症患者的脂代谢如磷脂，甾体代谢物等改变[31]，提示神经细胞膜及神经元活动相关脂质的异常参与精神分裂症的分子机制。不饱和脂肪酸如棕榈油酸和油酸的神经保护作用已有报道，Yang等人基于代谢组学的研究发现精神分裂症患者提示上调的脂肪酸分解代谢可能是由于代偿下降的糖代谢水平，弥补能量供应的不足[25]。结合以上发现，能量代谢的紊乱可能进一步导致广泛的糖、脂、氨基酸、神经递质代谢的改变，与精神分裂症的发病密切相关。

综上所述，在精神分裂症的代谢组学研究中，基于多元统计模式识别方法对信息量巨大的代谢组学数据进行分析，有利于挖掘与疾病病理生理机制相关的代谢特征。本研究利用单变量分析联合多元模式识别方法筛选差异代谢物，进一步发现了以TCA循环为核心的能量代谢障碍在精神分裂症发病中的重要作用。未来针对能量代谢相关分子改变的研究将有助于了解精神分裂症的本质，成为研究其发病机制的突破口。