2018年铜川地区儿童嗜血杆菌耐药监测分析

任亚文，张甲龙，贺 蕾，张碧莹，张 娜

铜川市人民医院检验科，陕西铜川 727000

嗜血杆菌是儿童呼吸道感染的常见病原菌，其中流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌居多。流感嗜血杆菌是一种机会致病菌，可引起多种感染，包括中耳炎、会厌炎、鼻窦炎和肺炎[1-2]。流感嗜血杆菌的传播主要通过直接接触携带者的呼吸道飞沫。新生儿可能会因吸入羊水或接触含有活菌的生殖道分泌物而感染[3-4]。如果未能及时有效治疗，流感嗜血杆菌感染可能会危及生命，例如引起菌血症和脑膜炎[5]。副流感嗜血杆菌为呼吸道正常菌群，但是人体免疫力下降时可能引起急慢性呼吸道感染或其他疾病。青霉素类、头孢菌素类及大环内酯类抗菌药物是治疗儿童呼吸道感染的主要经验性用药，近年来，随着临床抗菌药物广泛应用，嗜血杆菌的耐药菌株不断增多，给临床治疗带来很大困难[6-7]。本研究旨在收集2018年临床住院患儿中分离的114株嗜血杆菌进行调查研究，以期为临床合理应用抗菌药物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 临床住院患儿(0～14岁)送检的合格痰液样本，对其进行涂片镜检，每个低倍镜视野内鳞状上皮细胞少于10个，白细胞多于25个，视为合格痰液样本。选取114株嗜血杆菌分离自2018年1月1日至12月31日儿科住院患儿的合格痰液样本。

1.2仪器与试剂

1.2.1培养基来源 嗜血杆菌巧克力平皿(用于分离)购自郑州安图公司，药敏HTM培养基购自温州康泰公司。

1.2.2鉴定和药敏纸片 鉴定用Vitek2 Compact及配套NH(VITEK 2 NH Test Card,NH)奈瑟菌/嗜血杆菌鉴定卡。用于测定β-内酰胺酶检测的头孢硝噻吩试剂和药敏试验选用的12种抗菌药物纸片：氨苄西林(10 μg)、阿莫西林/克拉维酸(20/10 μg)、阿奇霉素(15 μg)、头孢曲松(30 μg)、亚胺培南(10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(100/10 μg)、美罗培南(10 μg)、头孢呋辛(30 μg)、复方磺胺甲噁唑(25 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢他啶(30 μg)、左氧氟沙星(5 μg)购自温州康泰公司。血清学分型所用生化管购自温州康泰公司。

1.3方法

1.3.1细菌培养及鉴定 按照《全国临床检验操作规程(4版)》[8]进行操作，将各种以划线分离法接种于嗜血杆菌巧克力平皿，孵箱(5%CO2，35 ℃)培养18～24 h。自嗜血杆菌巧克力平皿挑取呈无色、透明、表面光滑、边缘整齐、似露滴状的湿润可疑菌落，进行革兰染色，分纯后菌落配3.0麦氏浊度菌液上NH卡鉴定，根据鉴定结果选取流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，并接种蔗糖、木糖和甘露糖生化管进行血清学分型，35 ℃孵育24 h。

1.3.2药敏试验 根据美国临床和实验室标准化协会《抗微生物药物敏感试验执行标准》进行药敏试验和结果判定，温州康泰公司的标准菌株ATCC49247为质控菌株，使用纸片扩散法对12种抗菌药物进行药敏试验。β-内酰胺酶测定用头孢硝噻吩纸片[9]，根据试剂说明书进行检测，并判断阴阳性。10 min内变红表示β-内酰胺酶阳性，不变色表示其为阴性。β-内酰胺酶测定阳性质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213,阴性质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.3.3嗜血杆菌生物学分型结果判断标准 流感嗜血杆菌根据吲哚、脲酶试验及鸟氨酸脱羧酶试验，分为8个生物分型，见表1。

表1 嗜血杆菌生物学分型结果判断标准

1.4统计学处理 采用WHONET 5.6分别统计流感与副流感嗜血杆菌菌株耐药性情况，采用SPSS22.0软件统计分析不同年龄段患者之间耐药率，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同年龄段患者菌株分离情况 本地区流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌分离情况见表2。

表2 不同年龄段患者菌株分离情况(n)

2.2菌株的生物学分型 铜川地区流感嗜血杆菌生物学流行株主要为Ⅱ型(32.00%)和Ⅲ型(30.00%)，副流感嗜血杆菌生物学流行株以Ⅲ型(38.46%)为主。见表3。

表3 嗜血杆菌生物学分型(%)

2.3药敏情况比较 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对左氧氟沙星、美罗培南、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦这4种抗菌药物敏感率均较高，未检测出耐药菌株。流感嗜血杆菌与副流感嗜血杆菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、阿奇霉素和复方磺胺甲噁唑敏感率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。经过头孢硝噻吩纸片试验，β-内酰胺酶阳株78株，占比68.42%，阴性36株中，氨苄西林耐药6株，占比为16.67%。

表4 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药情况(%)

续表4 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药情况(%)

3 讨 论

本研究结果显示，嗜血杆菌感染主要为0～<1岁患儿，这与孙曹玮[10]和文献[11]报道结果相符。流感嗜血杆菌是引起婴幼儿呼吸系统感染的常见病原菌之一，并在健康婴幼儿鼻咽部具有较高的定植率。免疫系统发育尚未健全，是婴幼儿流感嗜血杆菌感染率高的原因之一[12]。

本研究发现,2018年铜川地区流感嗜血杆菌菌株生物学分型以Ⅱ型(32.00%)和Ⅲ型(30.00%)为主，这与胡俊等[13]报道结果不同，提示其可能存在地区间差异性。副流感嗜血杆菌株生物学分型以Ⅲ型为主，这与文献[11]报道结果不同。这提示不同地区之间嗜血杆菌流行株不同。迄今为止,流感嗜血杆菌生物学分型与其毒力和耐药的关系尚不十分清楚，尚待进一步研究。氨苄西林作为治疗嗜血杆菌感染的首选药物，随着使用的增加，该菌对其的耐药率也逐年上升[14]。本研究中流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率为68.06%，低于温晓峥等[15]报道结果，但明显高于孙燕等[16]报道结果。副流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率为73.17%。

本研究发现，嗜血杆菌对氨苄西林耐药率和β-内酰胺酶阳性率均超过50.00%，说明本院嗜血杆菌对氨苄西林的耐药机制主要以产β-内酰胺酶为主。另外，本研究中114株嗜血杆菌中β-内酰胺酶阴性嗜血杆菌对氨苄西林耐药占16.67%，高于秦惠宏等[17]报道结果，可能是青霉素结合蛋白结构发生改变，导致其对氨苄西林的亲和力下降及外膜蛋白发生改变[18]。

综上所述，目前产β-内酰胺酶的嗜血杆菌分离株占比较高，表明氨苄西林已不能作为临床一线药物，而且儿童感染的嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药性已十分严重。因此，对嗜血杆菌的耐药性进行监测从而指导临床合理使用抗菌药物具有重要意义。但是，本次研究样本量偏小，来源单一，且抗菌药物与菌种的匹配度亦有待完善，故上述结论尚有待大样本、多中心的前瞻性研究来予以验证。