孕早期血清同型半胱氨酸水平和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病的相关性研究

赵雪娅 陈 莎 程蔚蔚

妊娠期高血压疾病是妊娠期妇女特有的疾病，包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫和慢性高血压并发子痫前期。其中，子痫前期是以血压升高和蛋白尿为主要表现，发病率为4%～8%[1]，是导致孕产妇和围产儿各种疾病发病率和死亡率升高的主要原因。目前，子痫的发病机制尚不清楚，其发生可能与子宫螺旋小动脉重塑不足、炎症免疫过度激活、血管内皮细胞损伤、遗传、营养等因素有关[2]。近年来的研究[3-4]发现，血清同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高增加了子痫前期的发生风险，而机体内叶酸代谢关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因位点的突变可影响Hcy的代谢。本研究旨在分析孕早期血清Hcy水平和MTHFR基因多态性与子痫前期发生的关系，以期为临床预测子痫前期的发生和探索其发生机制提供新的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2018年1—5月在上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院进行定期产前检查(简称产检)并分娩的孕妇128例，根据妊娠结局分为正常妊娠组(46例)、妊娠期高血压组(41例)、子痫前期组(41例)。排除标准：①双胎或多胎妊娠；②孕前合并高血压、肾脏疾病、甲状腺疾病、糖尿病等基础疾病；③有精神疾病病史；④利用辅助生殖技术或促排卵受孕。妊娠期高血压疾病的诊断标准参照人民卫生出版社第九版《妇产科学》[5]。妊娠期高血压定义为妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mmHg，于产后12周内恢复正常；尿蛋白(-)。子痫前期定义为妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg，伴有24 h尿蛋白定量≥0.3 g，或随机尿蛋白(+);尿蛋白(-)时合并下列任何1项：血小板计数减少(<100×109/L)，肝功能受损(血清转氨酶水平>正常值上限的2倍)，肾功能受损(血清肌酐水平>1.1 mg/dL，1 mg/dL=88.4 mmol/L,或>正常值上限的2倍)，肺水肿，新发生的中枢神经系统异常或视觉障碍。本研究经医院伦理委员会审核和批准[批准号为国科伦委(GKLW)2017-102]，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2 方法 本研究为病例对照研究。收集所有孕妇的一般资料(年龄、BMI、分娩孕周、孕次、产次、新生儿体重),检测孕早期(孕10～14周)孕妇的血清学指标(Hcy、叶酸、维生素B12)和MTHFR基因rs1801133多态性。

1.2.1 孕早期血清学指标检测 采用循环酶法检测所有孕妇血清Hcy水平(使用罗氏公司试剂)，采用化学发光法检测孕妇血清叶酸、维生素B12水平(使用雅培公司ARCHITECT tc1600生化分析系统)。

1.2.2MTHFR基因rs1801133多态性检测 取孕妇的外周血标本2 mL，置入含有EDTA的抗凝管中，混匀离心后取下层血细胞，按照基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取血细胞中的DNA。应用Primer 7.0软件设计PCR引物，引物序列分别为5’-TGG AAG GTG CAA GAT CAG A-3’、5’-TCA CAA AGC GGA AGA ATG TG-3’。PCR扩增程序：95 °C预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45个循环。将反应后的产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，取30 μL扩增样品送至上海生物工程公司进行测序分析。

2 结 果

2.1 3组一般资料比较 妊娠期高血压组、子痫前期组孕妇的年龄均显著大于正常妊娠组(P值均<0.05)，BMI均显著高于正常妊娠组(P值均<0.05)。妊娠期高血压组、子痫前期组孕妇分娩孕周均显著短于正常妊娠组(P值均<0.05)，新生儿体重均显著低于正常妊娠组(P值均<0.05)。3组间孕妇孕次、产次的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 3组孕妇一般资料的比较

2.2 3组孕妇孕早期血清学指标比较 子痫前期组血清Hcy水平和维生素B12水平均显著高于正常妊娠组和妊娠期高血压组(P值均<0.05)。见表2。

表2 3组孕妇孕早期血清学指标的比较

2.3MTHFR基因rs1801133位点各基因型基因频率比较 3组间MTHFR基因rs1801133位点CC型(野生型)、CT型(杂合突变型)和TT型(纯和突变型)基因频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表3。

表3 3组孕妇MTHFR基因rs1801133位点各基因型频率比较 [n(%)]

2.4MTHFR基因rs1801133位点各基因型孕妇孕早期血清学指标比较MTHFR基因rs1801133位点TT型孕妇的血清Hcy水平显著高于CC型和CT型患者(P值均<0.05)，各基因型孕妇间血清叶酸和维生素B12水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表4。

表4 MTHFR基因rs1801133位点各基因型孕妇孕早期血清学指标的比较

2.5 子痫前期发生的相关危险因素分析 校正年龄、BMI、 孕次、 产次等因素影响后，logistic回归分析结果显示，孕早期血清Hcy水平升高是子痫前期发生的危险因素(OR=1.736，95%CI为1.141～2.622，P=0.010)。见表5。

表5 子痫前期发生的影响因素logistic回归分析结果

3 讨 论

妊娠期高血压疾病是产科的常见疾病，子痫前期是其中的严重类型，其发生机制至今尚未被完全阐明。两阶段学说是目前较被公认的子痫前期发生机制:第一阶段主要为胎盘缺血缺氧导致胎盘浅着床;第二阶段主要是由第一阶段造成的临床表现[6]。血管内皮损伤是子痫前期发病的关键环节。近年来，越来越多的研究结果表明，高Hcy血症与子痫前期的发生具有一定相关性。

Hcy是一种含有巯基的氨基酸，是甲硫氨酸代谢过程的中间产物，主要通过再甲基化和转硫化两种途径代谢[7]。在再甲基化的过程中，Hcy在甲硫氨酸合成酶的催化下结合由N5-甲基四氢叶酸提供的甲基，以维生素B12为辅酶。其中，N5-甲基四氢叶酸由MTHFR参与还原而得，故人体内血清叶酸、维生素B12的水平均可影响Hcy的代谢。人体内血清叶酸、维生素B12缺乏(摄入不足或排出过多)可导致Hcy水平升高。本研究结果显示，子痫前期组孕妇孕早期血清维生素B12水平显著高于正常妊娠组，可能与样本量不足、样本偏差等因素有关。在转硫化途径中，主要由胱硫醚β-合酶和胱硫醚γ-裂解酶参与反应，该反应依赖维生素B6为辅因子[8-9]。人体内血清Hcy水平处于平衡状态时，一旦以上代谢途径受阻或MTHFR基因位点发生突变，会导致高Hcy血症的发生，对人体产生危害。

本研究结果显示，子痫前期组孕妇孕早期血清Hcy水平显著高于正常妊娠组和妊娠期高血压组；logistic回归分析结果显示，孕早期血清Hcy水平升高是子痫前期发生的危险因素，与anlikan等[10]的研究结果一致。子痫前期的发生机制中，血管内皮损伤是关键环节，高浓度的血清Hcy可能通过多种机制导致血管内皮功能发生障碍，进而参与子痫前期的发生、发展。根据现阶段对血管内皮调节机制的研究，高浓度的血清Hcy可能导致子痫前期血管内皮损伤的潜在机制如下：①氧化应激，NO合酶活性的破坏性解偶联，NO淬火和酶抑制；②内质网应激与血管内皮细胞凋亡；③慢性炎症和(或)血栓形成前状况(Hcy诱导的慢性炎症可能导致内皮依赖性扩张，同时Hcy也诱导血栓形成)[11]。

MTHFR基因中存在>40个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)位点，其中rs1801133基因型分为CC型(野生型)、CT型(杂合突变型)和TT型(纯和突变型)，以CC型和CT型多见，TT型相对少见[12]。本研究结果显示，正常妊娠组、妊娠期高血压组、子痫前期组携带TT型基因的孕妇分别占19.6%、22.0%、26.8%，与上述研究结果相符。MTHFR基因rs1801133位点的这种错义突变使得MTHFR的酶活性明显下降，尤其是携带TT基因型个体的MTHFR的酶活性可降低60%[13]，使得Hcy的甲基化发生障碍，导致血清Hcy水平升高，发生Hcy血症。

本研究MTHFR基因rs1801133多态性检测结果显示，携带TT基因型的孕妇血清Hcy水平显著高于CC和CT型，但logistic回归分析发现携带TT基因型的孕妇不是发生子痫前期的危险因素。上述结果表明，TT型突变可能引起体内MTHFR的活性降低引起高Hcy血症，从而进一步增加子痫前期发生的风险。因此，对妊娠早期血清Hcy水平升高的孕妇进行MTHFR基因rs1801133多态性检测，对预测子痫前期具有重要意义。

本研究的局限性为样本量较少，希望在今后的研究中增加样本量，并通过前瞻性研究探讨不同孕期时血清Hcy水平对子痫前期发生的预测价值。

综上所述，MTHFR基因rs1801133位点突变导致子痫前期发生的机制可能是突变导致血清Hcy水平升高，损伤血管内皮，从而促进子痫前期的发生、发展。MTHFR基因突变是血清Hcy水平升高的危险因素，但引起子痫前期发生的可能是高Hcy血症。因此，对于孕早期血清Hcy水平升高的孕妇建议增加叶酸的补充剂量，同时进一步检测MTHFR基因突变情况，以指导叶酸的补充剂量，减少子痫前期发生的风险。