趋化因子CXCR4、CXCL5在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

李 杰 沈雁冰 文秀华

肾实质癌是来源于肾小管上皮细胞的腺癌，85%为透明细胞癌[1]。肾透明细胞癌的早期通常无症状，或只有发热、乏力等全身症状，肿瘤体积增大时才被发现[2]。肾透明细胞癌在泌尿系统所有的肿瘤中死亡率最高，淋巴系统转移是临床上治疗效果不佳的主要原因之一[3]。因此对于肾透明细胞癌的早期发现和判断至关重要。肿瘤的生长和转移多依赖于宿主细胞和肿瘤细胞的相互作用，而趋化因子在这种相互作用中起到了重要作用[4]。越来越多的证据表明，趋化因子参与了肿瘤的转移过程，其中趋化因子5(CXCL5)在膀胱癌、前列腺癌等恶性肿瘤中出现高表达，近年来报道证实其直接参与恶性肿瘤进展过程，通过增强细胞增殖和迁移而促进肿瘤转移。趋化因子受体4(CXCR4)是一种广泛存在于不同类型细胞表面上的 G 蛋白偶联受体，已被证实是人类恶性肿瘤中最常见的趋化因子受体，在乳腺癌、肺癌、直肠癌中均有表达。相关研究表示 CXCR4 在机体生长、器官和血管形成、红细胞生成中均起到了非常重要的作用，并通过激活一系列信号转导途径和效应分子，直接参与恶性肿瘤的发生、发展和转移的过程[5]。两者与肿瘤的转移和生长息息相关，因此，本研究通过测试趋化因子CXCR4、CXCL5的含量和肾透明细胞癌的临床特征的相关性，探索两者的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2019年1月在我院肿瘤科进行诊治的肾透明细胞癌患者共50例，所有患者均经过病理学检查证实。男性21例，女性29例；年龄47～63岁，平均年龄为(51.21±4.57)岁；根据癌细胞核分级将患者分为4级：Ⅰ级23例，Ⅱ级5例，Ⅲ级17例，Ⅳ级5例；根据Robson分期法将患者分为Ⅰ期31例，Ⅱ期10例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例。标本取自手术过程中切除的癌组织和癌旁正常组织。本研究方案已经通过我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 ①诊断均符合2014版肾细胞癌诊断治疗指南诊断标准[6]，均为首次发病；②术前均未行放疗、化疗等肿瘤特异性治疗；③无溶血性疾病；④无原发性或继发性痛风、尿毒症、激素代谢紊乱。

1.2.2 排除标准 ①陈旧性心肌梗死、心力衰竭及其他引起心脏形态结构改变的疾病；②外科手术未能切除肾癌病变；③术后病理诊断不明确，组织学分类不清楚；④术后标本保存不完好，没有足够的待测组织。

1.3 方法

1.3.1 标本制作 将手术过程中切除的肾透明细胞肿瘤组织和肿瘤旁小于2 cm区域的正常组织用10%的甲醛固定，并用石蜡进行包埋，然后将组织用单片机行4 μm切片，液氮保存。

1.3.2 HE染色 首先进行标本脱蜡，用二甲苯和乙醇浸泡半小时后，再放入碳酸锂饱和溶液中1 min，伊红溶液中5 min，流水冲洗。滴加3%H2O2阻断内源性过氧化酶，避光孵育15 min后，用三羟甲基氨基甲烷洗涤3次，置于95%以上的柠檬酸缓冲液中煮沸40 min。后滴加EnVision+HRP反应液，后滴加DAB显色剂工作液3，3+-二氨基联苯胺，光镜下控制显色，显色完全后冲洗，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明后用常规树脂封片。

1.3.3 CXCR4与CXCL5阳性判断 CXCR4与CXCL5指标的阳性判断均采用综合评分法，根据染色强度及着色面积对两者进行判断。首先在染色强度上，将无染色记为0分，淡黄色记为1分、黄色至棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据标本阳性细胞占总细胞数的百分率，分为≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。将两者积分相乘，0分阴性，1～4分为弱阳性，5～9为阳性，9分以上为强阳性。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 趋化因子CXCR4、CXCL5在癌组织及癌旁组织中的表达水平比较

癌组织中趋化因子CXCR4、CXCL5的表达水平均显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 癌组织中及癌旁组织中CXCR4、CXCL5表达水平比较

2.2 趋化因子CXCR4、CXCL5表达与患者临床特征的关系

趋化因子CXCR4、CXCL5在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率显著高于Ⅰ、Ⅱ期(χ2=6.270、6.131，P=0.012、0.013)，在低分化组织中阳性表达率显著高于中、高分化组织(χ2=3.889、6.250，P=0.048、0.012)，在有淋巴转移的患者中阳性表达率显著高于无淋巴转移的患者(χ2=4.955、6.832，P=0.026、0.009)，见表2。

表2 趋化因子CXCR4、CXCL5与患者临床特征的关系(例，%)

2.3 趋化因子CXCR4、CXCL5在肾透明细胞癌组织中表达的相关性

趋化因子CXCR4、CXCL5在肾透明细胞癌组织中表达呈正相关(=0.467，Kappa=0.740，P=0.001)。见表3。

表3 趋化因子CXCR4、CXCL5与肾透明细胞癌组织中表达的相关性/例

3 讨论

肾透明细胞癌约占人类恶性肿瘤总数的3%，近年来发病也呈现着越来越高的趋势，并且有将近50%的患者在被发现时就是晚期[7-8]。在临床上，肾透明细胞癌的诊断主要依据是病理学检测、影像学检查，但是也存在一定的局限性[3]。而目前来说，肾透明细胞癌的发生及进展机制还尚不明确，而学术界目前普遍认为是归于VHL抑癌基因的突变，造成了基因产物pvhl的缺失，从而使HIF-1A进入细胞核，进而让一系列缺氧诱导基因上调[9]，其中CXCR4和CXCL5两种趋化因子就是其中的重要因素。肿瘤微环境也是近年来医学界研究的热点[10]，而 CXCR4和CXCL5在人体内通过一系列的信号传导，直接参与恶性肿瘤的发展和转移，是诊断和治疗肾透明细胞癌的一个重要的切入点。

首先，由本研究的数据可知，相对于癌旁组织，癌组织的趋化因子CXCR4、CXCL5表达水平明显升高，两者的表达水平在肾透明细胞癌组织表达中呈正相关。研究发现CXCR4基因在众多癌症中例如前列腺癌、直肠癌等的组织中均有高表达，并且表达量随病变恶性程度加重而增加，同时，有关研究表示CXCL5表达量升高后，肿瘤的生长、转移及血管形成能力显著增强，有相关报道表示CXCL5在临床高分期的恶性黑色素瘤中呈现出极高表达[11]。本研究的数据表示，阳性患者和阴性患者的趋化因子阳性表达数值也有极大差异，提示CXCR4和CXCL5的表达水平和肿瘤的发展程度也成正相关。CXCR4和CXCL5作为膜相关的受体蛋白，在肿瘤细胞中出现了高表达，阳性率最高达到了95.2%，远高于癌旁正常组织。CXCR4是高度保守的7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体[12]，其编码基因位于染色体2q21，CXCL5 主要由淋巴细胞、巨噬细胞等细胞外基质中合成，在肿瘤细胞合成和分泌中有重要作用[13]。两者是细胞间互相通讯的重要调控分子，通过复杂的信号交流网络参与肿瘤细胞的合成生长。作用机制研究表明CXCR4和CXCL5可激活肿瘤细胞内多种信号通路，如 MAPK、CAMP和蛋白激酶 A等通路，在多种肿瘤的侵袭、发展、转移过程发挥重要作用。当这两种趋化因子和靶细胞膜表面受体—7次跨膜G蛋白偶联受体结合时，就会触发下游效应物的活化和信号肽的级联效应，从而加快肾透明细胞癌的恶性发展[5]。

根据研究显示，在不同恶性程度的肿瘤患者中，CXCR4和CXCL5的阳性表达率表现出了差异，表示两者在恶性肿瘤的扩散和对淋巴转移的影响上起着重要作用。而根据本研究的实验数据得知，两者的阳性表达都和患者的TNM、组织学分级、淋巴结转移具有极大的相关性。淋巴途径转移在人体许多肿瘤转移中占有重要地位，经相关性分析发现，在患者的转移淋巴结组织中 CXCL5和 CXCR4 的表达具有正相关性。血管生成与肿瘤的发展、淋巴结的转移均关系密切，新生血管可以为肿瘤的生长提供更多的养分，并且将产生的废物排出体外。趋化因子就是在血管生成过程中发挥重要功能的分子[14]。CXCL4是第一个被发现参与血管生成抑制的分子，CXCR4的活化可以通过一定的信号通路活化 NF-KB，而反过来，活化的NF-KB又可以通过诱导趋化因子的活跃，从而促进血管生成，加快肿瘤的生长。据相关资料显示，CXCR4和CXCL5生物轴对于肾透明细胞癌的患者的血管新生以及肿瘤生长都有促进作用，同时可介导免疫及炎症因子趋化，调控造血干细胞迁移和归巢[15]。根据张翠薇的动物实验表示，CXCL5和CXCR4能趋化骨髓来源抑制性细胞回归肿瘤，两者的抗体联合PD-1的治疗可以增加患者的CD4+和CD8+的浸润，减轻肿瘤的扩散[5，16]。相关报道显示，在肾透明细胞癌组织中，CXCR4 的表达分布于胞膜及胞浆，肾癌病理分级高分级组的光密度值较低分级组高，差异也较为显著，表示了CXCR4与癌细胞的增殖和TNM的分期程度有紧密的联系[17]。已有学者研究证实，利用RNAi 技术，以 siRNA 抑制 CXCR4 表达，不仅可抑制癌细胞在体内外的趋化性转移，还可减少体内原发癌的形成，抑制癌细胞的增殖[18]。因此，对 CXCR4 和CXCL5的活性进行抑制，也可减少肾透明细胞癌的转移，这可能是治疗肾透明细胞癌的一个新的研究方向。

综上所述，CXCR4和CXCL5在肾透明细胞癌组织中高表达，且与患者的TNM分期、组织学分级和淋巴结转移关系紧密，综合检测两种趋化因子可作为肾透明细胞癌的重要诊断依据和判断预后效果的生物学指标。