齐墩果酸衍生物的合成及其抗癌活性的研究
2021-07-07张蓬勃宋艳玲
张蓬勃,宋艳玲
(沈阳化工大学 制药与生物工程学院, 辽宁 沈阳 110142)
齐墩果酸的立体结构十分独特,是一类生物活性多样化的天然产物,具有保肝、抗炎、降血糖、降血脂和抗病毒[1-4]等作用,特别是其具有很强的抗肿瘤活性[5],由于其对肿瘤细胞选择性的毒性作用而对正常细胞并无不良影响的特性,使此类化合物成为国内外抗肿瘤药物重点研究的对象之一.齐墩果酸对非小细胞癌、黑色素瘤及卵巢癌等均表现出一定的抑制能力[6];另外,齐墩果酸还可抑制K562白血病细胞株的生长,并促使细胞凋亡[7];对肺癌细胞的研究中发现齐墩果酸可介导其细胞的凋亡进程.总之,针对齐墩果酸抗肿瘤活性的研究表明齐墩果酸可介导肿瘤细胞的生长、转移以及凋亡,其作用机理贯穿了肿瘤发展的各个阶段[8].
Chen等[9]将苯磺酰基呋喃氧化物、苯基呋喃氧化物与琥珀酸基经反应偶联到齐墩果酸的C-3位羟基,合成了一系列齐墩果酸杂合呋喃唑酮衍生物.研究发现,此类化合物能控制一氧化氮的合成与释放,是一种潜在的肝癌治疗药物,化合物浓度为1 μmol/L时,对肝癌细胞HepG2的抑制率为100 %,为活性最佳的化合物.苏春华等[10]先将乙酰氧基连入齐墩果酸的C-3位,再将C-28位羧基与α-氨基磷酸酯通过酰胺键引入到C-3位的乙酰氧基上,合成了一类齐墩果酸α-氨基磷酸酯衍生物.其体外抗肿瘤活性显示,对HeLa细胞的抑制率超过了78 %.查阅已发表的文献,对齐墩果酸的结构改造多为C-3位和C-28位,本文对齐墩果酸A环进行开环反应,从而设计一系列新型化合物,以期提高目标化合物的生物活性和生物利用度.扩展了齐墩果烷型五环三萜的结构多样性,这对于OA的进一步开发利用具有重要意义.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Bruker ARX-600型核磁共振仪,美国Bruker公司;Büchi B-540熔点测定仪,瑞士Büchi公司;薄层色谱(GF-254)、柱色谱硅胶(200~300目),青岛海洋化工有限公司;齐墩果酸(质量分数98 %),陕西慈缘生物技术有限公司;芳香胺类药品,上海麦克林生化科技有限公司.其他溶剂和药品均为分析纯.
1.2 合成实验
齐墩果酸衍生物合成路线图1所示.
反应试剂和条件:(a) 琼斯试剂,丙酮,异丙醇,0 ℃; (b) 甲酸乙酯,甲苯,甲醇钠,25 ℃; (c) 甲醇钠,质量分数30 %的过氧化氢,甲醇,室温; (d) 芳香酰氯,二氯甲烷,40 ℃; (e) 芳香胺,4-二甲氨基吡啶,吡啶,室温.
1.2.1 3-羰基-齐墩果酸(1)的制备
将齐墩果酸(4.40 g,9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中,冰浴下缓慢滴加琼斯试剂(11.5 mL),直至反应液橘红色不再消失,滴毕,室温下反应1~2 h,TLC监测反应.反应完毕,加入130 mL异丙醇淬灭.反应结束后,减压蒸除部分溶剂,乙酸乙酯萃取,饱和NaCl溶液洗涤,水洗,合并有机相,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干,得淡黄绿色固体,干燥,甲醇重结晶得白色晶体化合物3-羰基-齐墩果酸4.15 g,产率95 %,mp 186~187 ℃(文献mp 185~186 ℃)[9].
1.2.2 2-羟基亚甲基-3-羰基-齐墩果酸(2)的制备
将3-羰基-齐墩果酸(4.15 g,8.87 mmol)溶于50 mL无水甲苯中,加入质量分数97 %甲酸乙酯(2.0 mL)、甲醇钠(3.76 g,69.54 mmol)25 ℃下反应3 h,TLC监测反应.反应结束后加入适量二氯甲烷稀释,质量分数5 %盐酸洗涤3次,饱和NaCl溶液洗涤,水洗,合并有机相,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干,得白色固体化合物2-羟基亚甲基-3-羰基-齐墩果酸3.73 g,产率89.8 %,mp 210~214 ℃(文献mp 211-212 ℃)[9].
1.2.3 2,3-甲酯基-齐墩果酸(3)的制备
将2-羟基亚甲基-3-羰基-齐墩果酸(2 g,4.14 mmol)溶于100 mL甲醇中,加入甲醇钠(2.24 g,41.40 mmol),冰浴条件下滴加质量分数30 %的H2O2(10 mL),0.5 h后撤冰,室温下反应3 h,TLC监测反应.反应结束后二氯甲烷萃取,蒸馏水洗涤,合并有机相,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干,得白色固体化合物2,3-甲酯基-齐墩果酸1.32 g,产率66 %,mp 221.3~223.7 ℃.
1.2.4 2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯(4)的制备
将2,3-甲酯基-齐墩果酸(1 g,1.89 mmol)溶于20 mL干燥二氯甲烷溶液中,冰浴条件下缓慢滴加草酰氯(1.19 g,9.43 mmol),0.5 h后撤冰,40 ℃下反应2h,TLC监测反应.反应结束后蒸发有机溶剂,干燥环己烷冲洗3次,蒸发得白色固体化合物2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯0.98 g,产率98 %.
1.2.5 化合物Ⅰ1-Ⅰ4的制备
1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制备
将2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯(0.15 g,0.274 mmol)溶于10 mL无水二氯甲烷中,缓慢滴入溶于10 mL苯胺(0.128 g,1.37 mmol)的二氯甲烷溶液,加入干燥吡啶(0.5 mL),4-二甲氨基吡啶(0.001 4 g,0.04 mmol)25~30 ℃条件下反应12 h,TLC监测反应.反应结束后二氯甲烷萃取,蒸馏水洗涤,合并有机相,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干,硅胶柱色谱分离,甲醇/二氯甲烷洗脱,得白色固体化合物Ⅰ10.083 g,产率55.3 %,mp 181~184 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ:7.88~7.83(2H,m,ph-H-2,H-6),7.51(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-4),7.16~7.07(2H,m,ph-H-3,H-5),6.48(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.00(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.91(3H,s,H-30).
1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制备
实验步骤同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯(0.15 g,0.274 mmol)与对甲基苯胺(0.148 g,1.37 mmol)反应,得白色固体化合物 Ⅰ20.079 g,产率52.6 %,mp 185~188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ:7.57~7.52(2H,m,ph-H-2,H-6),7.15~7.07(2H,m,ph-H-3,H-5),6.50(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.38(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.56(3H,s,3-COOCH3),2.33(3H,d,J=9.2 Hz,ph-CH3),1.21(6H,s,H-23、H-24),1.01(3H,s,H-25),0.96(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-29),0.93(3H,s,H-27),0.89(3H,s,H-30).
1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制备
实验步骤同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯(0.15 g,0.274 mmol)与对氯苯胺(0.175 g,1.37 mmol)反应,得白色固体化合物 Ⅰ30.073 g,产率48.6 %,mp 184~185 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ:7.99(2H,d,J=8.8 Hz,ph-H-2,H-6),7.65(2H,d,J=8.7 Hz,ph-H-3,H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.08(3H,s,H-25),0.89(3H,s,H-26),0.86(3H,s,H-29),0.82(3H,s,H-27),0.79(3H,s,H-30).
1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制备
实验步骤同化合物Ⅰ1.2,3-甲氧酯基-齐墩果酸酰氯(0.15 g,0.274 mmol)与邻甲氧基苯胺(0.169 g,1.37 mmol)反应,得白色固体化合物 Ⅰ40.066 g,产率44 %,mp 187~188 ℃.1H-NMR(600 MHz,CDC13),δ:8.01(1H,t,J=7.2 Hz,ph-H-3),7.88~7.83(2H,m,ph-H-4,H-6),7.40(1H,t,J=7.1 Hz,ph-H-5),6.51(1H,t,J=5.4 Hz,CONH),5.40(1H,t,J=3.4 Hz,H-12),3.57(3H,s,2-COOCH3),3.53(3H,s,3-COOCH3),2.54(3H,s,ph-OCH3),1.20(6H,s,H-23、H-24),1.04(3H,s,H-25),0.93(3H,s,H-26),0.89(3H,s,H-29),0.83(3H,s,H-27),0.80(3H,s,H-30).
2 抗肿瘤活性实验结果与讨论
选取舒尼替尼为阳性对照药,舒尼替尼结构中含有脲基活性片段,其抑制活性具有参考意义.取对数生长期的人肺癌细胞(A549)和人胃癌细胞(SGC7901)以每孔5×103个接种于96孔板内,每组3个复孔,CO2培养箱中培养24 h后备用.待细胞贴壁后,分别加入待测化合物(Ⅰ1~Ⅰ4)、OA和舒尼替尼,药品浓度为10 μmol/L,空白组为阴性对照组,舒尼替尼为阳性对照组.培养箱中继续培养72 h.加入MTT溶液(5 g/L,20 μL),继续培养4 h,吸去每孔上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)200 μL,震荡器上震荡5 min,然后用酶标仪于570 nm处测OD值,重复3次实验,取平均值,计算各组细胞的IC50.
抑制率=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100 %.
化合物抗肿瘤活性和抑制率见表1.由表1数据可以看出:化合物Ⅰ4对A549、SGC7901细胞具有良好的抑制作用,优于阳性对照药舒尼替尼(13.3 μmol·L-1);苯环上取代官能团的改变,其抑制率具有差别;邻位的甲氧基团活性最好,氯原子活性稍差(21.8 μmol·L-1),对位甲基活性差(26.1 μmol·L-1),无取代基苯环活性最低(35.3 μmol·L-1).设计合成的4个化合物均优于原料OA.
表1 化合物对A549和SGC7901细胞株的抗肿瘤活性Table 1 Anti-tumor activity of the target compounds on A549 and SGC7901 cell lines
3 结 论
设计并合成了4个未见文献报道的OA衍生物(Ⅰ1~Ⅰ4),活性实验表明除化合物Ⅰ1外,其他化合物对A549和SGC7901细胞均有明显的抑制作用.尤其是化合物Ⅰ4对A549细胞具有良好的抑制作用,优于阳性对照药舒尼替尼.该类化合物构效关系正在进一步研究,该研究结果对齐墩果酸衍生物的进一步优化设计具有一定的指导意义.