人尿液细胞的培养及生长特性分析

阮愕舒，王 烁，石兰岚，2，王廷华，2，杨建宇*

(1.昆明医科大学基础医学院；2.昆明医科大学动物学部，云南 昆明 650500)

尿液作为生理排泄物，尿液中除了含有水、无机盐与糖外，还含有一些人尿液细胞(Human urine cell，HUC)和极少量的尿源性干细胞等，其中，HUC主要包括脱落的尿道上皮细胞、肾小管上皮细胞，也为肾细胞[1]。HUC可以通过一定的方法和小分子物质在体外进行增殖培养[2]，同时，大量的H统称UC可在体外通过一些细胞因子和小分子物质进一步经诱导转分化为肝细胞、胰岛细胞或者神经细胞[3]等具有一定临床应用价值的成体细胞，由于HUC具有易得、无创性、无排斥反应及不涉及伦理问题等优点，为成体细胞治疗疾病提供丰富、易得和可靠的细胞来源。HUC还可以用于脊髓性肌萎缩症等疾病的诊断和发病机制研究[4-5]。我们拟建立一种可行、可靠、系统性的HUC培养体系，分析HUC的生长特性，拟为将来利用HUC体外转分化为所需要成体细胞后进行临床细胞移植治疗疾病提供大量HUC。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 基本材料 移液器一套及各种吸嘴，各种规格的培养板、培养瓶，50 mL和15 mL的离心管等。将以上实验材料提前在紫外线照射下灭菌，对培养板用明胶包被后放入37℃、5%CO2培养箱中孵育备用。

1.1.2 细胞培养用材料 明胶Gelatin，Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)/F12，青霉素和链霉素，胎牛血清，Renal Epithelial Cell Growth Basal Medium(REBM)和Bullet Kit小分子套装(CC-3190，LONZA)，台盼蓝。

1.2 实验方法

1.2.1 采集尿液样本 在尿液取样室中，用取样瓶取新鲜人尿液43份，记录尿液捐献者年龄、性别以及捐献的尿液量。尽快对尿液样本进行细胞的分离和培养。

1.2.2 HUC的分离与培养 将分装后的尿液在离心机中离心，离心后轻缓弃去上清液，留下细胞微球，再加入含双抗的PBS液轻微吹散细胞球后再次离心，弃上清后在获得的细胞球离心管中，加入HUC基础培养基混匀后接种到用明胶包被好的培养板中，将培养板放入5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。24 h后用HUC基础培养基全量换液，48 h后HUC扩增培养基，每隔1 d换50%HUC扩增培养基，直到细胞密度达70%以上开始传代。

1.3 HUC的形态特点及生长曲线的绘制

用荧光显微镜对不同时间HUC进行形态学观察，分析HUC的形态特征。用台盼蓝染色并对活细胞进行计数，绘制生长曲线，分析HUC的生长特性。

2 结果

2.1 原代HUC的形态特征

原代HUC通过培养一般在4～6 d开始出现细胞群落(见图1A)，群落比较分散，容易在培养孔边缘最先发现(见图1B)。好的尿液样本往往多处观察到细胞群落，显微镜下可见，原代HUC呈梭形或米粒状，该细胞为贴壁生长型细胞，且有密度依赖性生长的特点(见图2)。

图1 尿液细胞原代培养明场拍照

图2 尿液细胞原代培养明场拍照

2.2 HUC生长特性

原代HUC培养后当密度达70%以上开始传代，经台盼蓝染色计数后发现，HUC从第4代开始细胞生长速度趋缓，并出现一些空泡状和多分支状细胞。细胞数目变少，生长活力下降如图3。对HUC 6个样本进行多次传代细胞计数后发现，HUC数目从第3代以后增殖开始逐渐减少，细胞活力下降(见图4)。

图3 尿液细胞P0～P5明场拍照

图4 尿液细胞生长曲线

2.3 HUC形态学分析

原代培养的HUC有圆形、梭形、多边形、不规则形等形态特点，此后细胞生长速度较快，以梭形细胞居多，不规则形细胞数目逐渐上升(见图5)。

图5 尿液细胞形态学观察

2.4 尿液捐献者的年龄、性别以及捐献尿液量与培养成功率分析

通过SPSS版本相关性双变量斯皮尔曼统计分析，可知尿液捐献者年龄与HUC培养成功率有相关性(P<0.05)。而尿液捐献者的性别、尿液量与HUC培养成功率并无相关性(P>0.05，见表1)。

表1 年龄、性别、尿液量与培养成功率相关性分析

3 讨论

本研究利用小分子物质从43个人尿液样本中成功培养出HUC 36份，培养成功率高达84%。经统计学分析发现，尿液捐献者的年龄与HUC培养成功率相关，年龄越小成功率越高，而尿液捐献者的性别和捐献尿液量并不影响HUC培养成功率。此外，研究发现，原本无菌的尿液由于含有大量营养成分，放置时间稍长，就容易被污染，而导致细胞培养失败，所有尿液样本取材后需尽快进行处理。

HUC形态有圆形、梭形、菱形、多边形以及一些不规则的形状，为贴壁生长且具有密度依赖性生长特点的细胞。其传代能力在P3后逐渐减弱，最多传至P5代后细胞活力下降明显，并且出现较多不规则的细胞伴有空泡。如果需要对HUC进行体外重编程或是分化诱导，最好选择P2～P3的HUC进行转分化。

从研究结果来看，我们可以从尿液中经培养获得HUC，因此尿液可以成为HUC的重要来源[6]。也为HUC的转分化或者去分化研究提供了一个重要的细胞来源[7]。HUC可用于组织工程，其目标是组织和器官的再生，可以用于治疗创伤、癌症和畸形等多种疾病。尿液来源的细胞因其收集和分离成本低、增殖效率高、分化程度高而被认为是组织工程种子细胞的候选细胞[8]。HUC可作为干细胞的来源[9]，如通过转分化得到临床上需要的成体细胞。尿液中的上皮细胞特别是肾小球上皮细胞(足细胞)的检查，可作为一种有价值的非侵入性方法来获取疾病活动或疾病类型的信息，并可用于门诊活检后的随访[10]。HUC及其分泌的细胞因子等可用于疾病诊断[11]。HUC培养步骤简单、无创伤性、患者及其家属的依从性好，是获取和保存患者来源标本的有效方法。我们建立这套系统的HUC培养方法可以有效地培养所需要的细胞，为进一步研究提供足量的尿液HUC。