8种痰液细菌血平板培养菌落生理盐水冲洗液MPT64检测结果分析

徐杰平 刘雪玲 黄土星 陈龙辉 李秀群 杜青林

清远市清新区人民医院，广东 511800

MPT64是结核分枝杆菌早期生长繁殖过程中大量分泌的一种24 kDa的蛋白质，是结核分枝杆菌复合群的特异性抗原，是目前结核实验诊断常用的检测靶标。有研究结果显示，MPT64对结核分枝杆菌诊断的敏感性和特异性分别为92%和95%，阴性似然比和阳性似然比分别为0.04和25.32，诊断比值比为639.60，受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）为0.99［1］。从诊断性试验的这些评价指标来看，MPT64检测无疑堪称结核分枝杆菌诊断的极佳实验。但是孟繁荣等［2］对痰标本直接进行MPB64检测的研究结果则对其特异性提出了质疑，其后续的相关研究更是观察到了金黄色葡萄球菌分泌介质中检测到MPB64［3］。为全面了解呼吸道感染菌对MPT64检测的影响，我们对50株痰细菌培养分离株的无菌生理盐水冲洗液进行了MPT64检测，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月至2020年12月期间本院呼吸内科、重症医学科、康复医学科、新生儿科、神经内科、冠心病监护病房、心血管内科送检的痰培养样本。

1.2 仪器与试剂 细菌分离培养用血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板，购自广州环凯生物技术有限公司。细菌鉴定应用法国梅里埃ATB细菌鉴定系统进行，细菌鉴定用目测鉴定纸条：肠杆菌和其他革兰阴性杆菌鉴定系统（API 20E），非苛养、非肠道革兰阴性杆菌鉴定系统（API 20NE），葡萄球菌属和微球菌属鉴定系统（API STAPH）。

1.3 细菌培养鉴定方法 主要步骤包括：①接种与培养。挑取脓性、有血部位痰样本采用分区划线法接种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37℃培养24～48 h；同时挑取同部位的痰样本涂片染色进行标本是否合格鉴定。②细菌菌属推断。结合3种培养基上细菌生长的有无、菌落特征、革兰染色特征以及G+球菌、G-杆菌等特征性生化反应试验确定细菌菌属。③细菌菌种鉴定。应用目测鉴定纸条在法国梅里埃ATB细菌鉴定系统中进行。具体操作严格按《全国临床检验操作规程（第4版）》和仪器、试剂说明书进行。

1.4 MPT64检测方法 主要步骤包括：①菌落冲洗液制备。选取生长旺盛区菌落，无菌吸取灭菌生理盐水约0.3 ml轻轻冲洗菌落，浸润3～5 min。②MPT64检测。无菌吸取菌落冲洗液100µl加入试剂检测样本孔，在15～60 min内观察结果：在检测线（T）及质控线（C）处均呈现紫红色条带者为阳性，只在质控线（C）处呈现紫红色条带者为阴性，质控线（C）处不呈现紫红色条带者需要重新进行实验。

1.5 统计学处理 应用Excel 2007收集、整理和分析研究资料，应用频数分布进行统计学描述。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 合格痰样本细菌培养分离鉴定情况 共分离培养、鉴定出细菌50株，包括铜绿假单胞菌15株、肺炎克雷伯菌9株、嗜麦芽窄食单胞菌8株、大肠埃希菌8株、金黄色葡萄球菌5株、鲍曼不动杆菌3株、表皮葡萄球菌1株、奇异变形杆菌1株。

2.2 菌落生理盐水冲洗液MPT64检测结果 在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌中分别有2、5、4、2株菌落生理盐水冲洗液MPT64检测阳性，同时铜绿假单胞菌中有1株呈现可疑阳性结果，具体情况见表1。

表1 痰液细菌血平板培养菌落生理盐水冲洗液MPT64检测结果

3 讨 论

目前，人们已经在细菌中发现了7种不同的分泌系统，将其蛋白质通过多种途径转运至菌体细胞之外，分泌的蛋白质可以通过促进细菌毒力、增强对感染细胞的附着、直接中毒靶细胞和破坏其功能方面等机制完成其生理活动与致病过程［4］。其中Ⅶ型分泌系统（typeⅦsecretion system，T7SS）在结核分枝杆菌中被发现，迄今为止的研究表明结核分枝杆菌至少含有5种T7SS（分别命名为ESX-1到ESX-5）［5］。众所周知，结核分枝杆菌具有十分复杂的细胞壁结构，分枝菌酸与细胞壁基质共价结合，形成了高度疏水、几乎不通透的分枝菌酸膜，蛋白质必须穿过分枝菌酸膜方能分泌到胞外环境，也许即为结核分枝杆菌拥有强大的T7SS的主要原因。结核分枝杆菌特异蛋白MPT64即经由这些系统分泌到菌体细胞之外，沉积于其生长环境之中，因此人们能够通过其培养滤液或菌体冲洗液的MTP64检测鉴定结核分枝杆菌或进行其他功能性试验（如结核分枝杆菌药物敏感性试验）［6-7］。MTP64由结核分枝杆菌RD-2区基因编码，一般认为是结核分枝杆菌特异性抗原［8］，但本研究发现在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌和金黄色葡萄球菌的菌落冲洗液中明确检测到了MTP64的存在，则成为需要深入探究的问题。

从细菌基因组方面看，我们尚未查见这些细菌基因组中有编码MTP64基因序列的相关报道，加之结核分枝杆菌RD-2区基因的保守特性，我们认为最大的可能是：在这些细菌的分泌物中存在与MTP64抗原特性类似的结构物，导致了检测方法学上的非特异性。目前人们已经发现在金黄色葡萄球菌、炭疽芽胞杆菌、皮疽诺卡氏菌、枯草芽胞杆菌、产单核细胞增生李斯特菌等细菌中均有T7SS的存在［9-10］，为什么没有分枝菌酸膜的这些细菌也需要结核分枝杆菌这一特定的分泌系统？或许可以如此推想：它们之所以拥有结核分枝杆菌这一特定的分泌系统，即是因为菌体细胞内有类似结核分枝杆菌蛋白的相关分泌蛋白需要不断转运到菌体之外，以实现其生理功能与致病功能。

但是无论如何，本研究的结果直接导致了对应用MPT64检测鉴定结核分枝杆菌问题的诸多困惑，亟待进行深入的研究，以解决相关的理论和实践问题。另外，究竟还有哪些细菌也会出现类似的情况，同样也值得人们进行更为广泛的探索。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。