通络玉液汤干预APDN、AngⅡ和细胞内Ca2+浓度对糖尿病大鼠大血管纤维化的影响

杨艳梅 张山起 李淑贞 胡庆 赵琳杰

(1沧州医学高等专科学校,河北 沧州 061001；2沧州职业技术学院)

调查显示〔1～3〕，中国成人糖尿病(DM)的患病率为10.9%，DM患者的全因死亡率明显高于无糖尿病者，其中DM造成的心血管疾病死亡率的增加尤为突出。血管纤维化是DM患者大血管组织学病变的主要特征之一〔4〕。本实验通过血清脂联素(APDN)、血管紧张素(Ang)Ⅱ和大血管细胞内Ca2+浓度等指标的观察，探讨通络玉液汤干预DM大鼠大血管纤维化的影响机制，揭示通络玉液汤对DM大血管的保护作用，为DM的防治提供线索。

1 材料与方法

1.1实验药物和试剂 通络玉液汤组成为生黄芪30 g，生晒参8 g，生山药20 g，知母10 g，麦冬15 g，花粉10 g，五味子9 g，葛根10 g，鸡内金6 g，当归尾15 g，丹参15 g，地龙8 g，生药购于沧州同仁堂药店。按传统工艺制备水煎，浓缩至含原方生药量1.7 g/ml的药液，4℃冰箱保存备用。链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于上海建宁生物科技公司。Ca2+荧光探针(Fluo-3 AM)购于中国碧云天公司。

1.2模型建立与药物干预 将体重170～190 g清洁级健康雄性SD大鼠72只〔购自天津军事医学科学院，编号：SCXX(军)2009-003〕适应性喂养1 w后，根据预实验结果，随机分为正常对照组20只(NC组，4 w、8 w组各10只)和模型组52只。给予模型组高糖高脂饲料(20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+67.5%基础饲料)喂养4 w后，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(先配制0.1 mmol/L，pH 4.4 的枸橼酸缓冲液，后在冰水中与STZ 配制成2%的浓度，5 min内用完)，72 h后采大鼠尾静脉血，随机血糖大于16.7 mmol/L为DM造模成功，持续高糖高脂饲料喂养6 w，即成为DM血管病变模型(造模成功47只，成功率约90%)。NC组一直采用普通饲料喂养，腹腔注射相同剂量浓度的柠檬酸钠缓冲液。将模型组大鼠随机分为DM组23只(4 w组11只、8 w组12只)和通络玉液汤组24只(TYD组，4 w、8 w组各12只)，通络液汤组按照人鼠等效剂量给予通络玉液汤煎剂17 g/(kg·d)灌胃；NC组和DM组每日给予相同剂量的生理盐水灌胃。

1.3APDN、AngⅡ、血糖、血脂和细胞内Ca2+浓度检测 大鼠禁食12 h后，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采颈总动脉血液，取其中的4 ml分离血清，双抗体夹心ELISA检测血清APDN和AngⅡ含量；其余血液用于检测血糖(强生快速血糖仪)和血脂(奥林巴斯 AU400 全自动生化分析仪)。经处理后腹主动脉平滑肌细胞，采用荧光探针Fluo-3 AM标记法在流式细胞仪488 nm激发波长下检测细胞内Ca2+浓度。

1.4腹主动脉血管形态学检查 大鼠处死后迅速切取腹主动脉血管，制成1 mm3小块，先后用4%戊二醛和1%锇酸固定，制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色后用透射电镜(Philips CM12)观察动脉血管的微细结构；另取一部分腹主动脉血管用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察动脉血管的病理变化。

1.5统计学方法 采用SPSS24.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组血糖、血脂检测结果比较 DM 4 w组、8 w组空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显高于同时间NC组(P<0.01)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显低于同时间NC组(P<0.01)；TYD 4 w组、8 w组FBG、TG、TC和LDL-C明显低于同时间DM组(P<0.01)，HDL-C明显高于同时间DM组(P<0.01)。见表1。

表1 各组血糖、血脂检测结果及血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌细胞内Ca2+浓度比较

2.2各组血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌细胞内Ca2+浓度比较 与同时间NC组比较，DM 4 w组、8 w组的APDN明显偏低，AngⅡ和细胞内Ca2+浓度明显偏高(P<0.01)；与同时间DM组比较，TYD 4 w组、8 w组的APDN明显偏高，AngⅡ和细胞内Ca2+浓度明显偏低，但Ca2+浓度及4 w AngⅡ仍明显高于NC组(P<0.01)；TYD 4 w组、8 w组间的APDN、AngⅡ和细胞内Ca2+浓度比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.3各组大血管形态结构比较 光镜下观察(见图1)：NC 4 w组、8 w组腹主动脉平滑肌细胞未见明显变形，且排列规则整齐。在DM 4 w组平滑肌细胞存在不同程度的缺失且排列紊乱，少数内皮细胞变性或坏死；DM 8 w组可见大部分平滑肌细胞变性、坏死且排列紊乱，内皮细胞缺失，有脂质沉积，并伴有明显的炎细胞浸润。TYD 4 w组可见少量平滑肌细胞变性、坏死且排列较规则整齐，内皮细胞缺失明显较少，脂质沉积减少，炎细胞浸润程度明显减轻；TYD 8 w组与TYD 4 w组没有明显差别。电镜下观察(见图2)：NC 4 w组、8 w组腹主动脉内皮细胞脂质略有肿胀。DM 4 w组内皮细胞脱落，可见胞质碎片，内皮下结缔组织肿胀；DM 8 w组内皮细胞表面突起、脱落，胞质内出现吞噬小泡，线粒体空泡化，细胞核不规则，内皮细胞游离面胞质缺损，胞质肿胀。TYD 4 w组内皮细胞局部脱落、细胞质略肿胀，线粒体部分空泡化，核间隙扩张，部分内皮细胞胞质游离面脱落；TYD 8 w组与TYD 4 w组没有明显差别。

图1 各组大鼠大血管光镜观察(HE，×400)

图2 各组大鼠大血管电镜观察

3 讨 论

大血管病变是DM后期严重的并发症，大血管发生动脉粥样硬化(AS)、狭窄甚至堵塞造成的缺血会严重影响运动功能和生活质量，而血管纤维化是大血管病变发生发展过程中的主要表现形式〔5〕。研究证实APDN是一种具有抗AS、促进血管再生等保护作用的脂肪细胞因子〔6～8〕：APDN可以缓解微血管内皮细胞炎症、抑制巨噬细胞因子(与AS的形成密切相关)的产生、抑制单核细胞或内皮细胞的黏附和髓样分化，还可以直接抑制血管细胞黏附分子(VCAM)-1、细胞间黏附分子1和E-选择蛋白等导致AS的分子；APDN可以通过内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、5腺苷磷酸活化蛋白激酶(AMPK) 和环氧合酶(COX)-2等重要的细胞内信号分子促进血运重建。而 AngⅡ是生物活性最强的效应肽，可促进血管AS形成、刺激血管形成纤维化病变，同时增加血管平滑肌细胞的Ca2+内流，影响大血管的功能〔9～11〕：AngⅡ可以通过产生活性氧、活化基质金属蛋白酶(MMP)、调节巨噬细胞的吞噬功能而加剧纤维帽的不稳定，进而导致AS斑块的不稳定；AngⅡ能够通过诱导转化生长因子(TGF)-β、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)-1和结缔组织生长因子(CTGF)的表达促进血管壁的纤维化；AngⅡ还可以促进血管平滑肌细胞的Ca2+内流和血管收缩，进而影响血管功能。故血清APDN 、AngⅡ是衡量动脉粥样硬化、血管平滑肌纤维化及功能紊乱的重要标志物。

玉液汤可益气滋阴、固肾止渴，目前被广泛用于DM、高血压等疾病的治疗，但目前尚未报道其对DM血管病变的疗效；生脉散可治疗气阴两虚证，近年来也常应用于治疗心血管病变〔12〕。鉴于DM血管病变瘀血阻络、气阴两虚的病机，本实验在玉液汤和生脉散的基础上加减化裁而成通络玉液汤，具有行活血通络、益气养阴之功效，以达到DM血管损伤的防治作用。

本研究结果显示，给予通络玉液汤干预后，糖尿病大鼠血清APDN明显恢复性升高，血清AngⅡ和腹主动脉平滑肌细胞内Ca2+浓度明显恢复性降低，FBG、TG、TC、LDL-C降低和HDL-C增高，镜下发现通络玉液汤可部分逆转糖尿病大鼠腹主动脉的纤维化。表明通络玉液汤可以通过升高血清APDN、降低血清AngⅡ和大血管平滑肌细胞内的Ca2+浓度来减轻大血管发生纤维化、保护糖尿病大血管，从而减缓糖尿病大血管病变的发生和发展。