行为学干预对血管性痴呆大鼠脑组织保护及CXCR4、β-catenin表达的影响

吕威力 邢雪松

(沈阳医学院 1病理学教研室，辽宁 沈阳 110034；2解剖学教研室)

缺血性脑损伤具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，是严重危害人类健康的疾病〔1～3〕。研究已经证实脑缺血能促进成年动物脑内神经干细胞(NSCs) 的增殖、迁移和分化，部分受损的神经元可被分化的新生神经元代替，从而在一定程度上改善神经功能缺损〔4〕。神经营养因子是一类可对神经元起调节作用的多肽分子。它不止能够调节神经元细胞的增殖分化，并且在脑组织缺血之后，保护受到再灌注损伤神经元，对神经元损伤后的修复及再生发挥重要作用〔5～7〕。脑源性神经生长因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)属于神经生长因子家族。研究发现，大脑中BDNF和GDNF的释放对缺血性和缺氧性脑损伤具有修复作用。本研究采用两血管阻断加硝普钠降压法制作大鼠血管性痴呆模型，研究缺血后海马CXCR4和β-catenin的变化及气味穿梭训练的干预效果，探讨气味穿梭训练干预对血管性痴呆大鼠脑组织保护及CXCR4、β-catenin表达的影响。

1 材料和方法

1.1血管性痴呆模型的制备 54只健康雄性wistar大鼠，8周龄，体重(230±10)g，购于沈阳医学院实验动物中心。将大鼠随机分为3组：假手术组(n=6)，模型组(3、7、14、21 d，n=6)，训练组(3、7、14、21 d，n=6)。采用两血管阻断加硝普钠降压法建立血管性痴呆大鼠模型。术前12 h禁食、4 h禁水。术前麻醉采用1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射，取仰卧位固定实验动物，常规消毒，颈正中切口2～3 cm，分离双侧颈总动脉(CCA)，夹闭10 min后再通10 min，需重复上述过程2次，分离时应小心避免拉扯大鼠的迷走神经，模型组大鼠在夹闭颈总前腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg)。术后放回笼中保温饲养，应用庆大霉素防止大鼠局部感染。实验过程中应用多导生物记录仪在测量并记录血压数值，大鼠在注射硝普钠前动脉压平均约为100 mmHg，注射硝普钠后血压平均值迅速下降至50～55 mmHg左右约持续2 min，后血压平均值缓慢上升至70 mmHg持续1 h。在建立血管性痴呆模型过程中保持大鼠肛温维持在(37±1)℃，目的防止温度降低对脑缺血损伤产生保护。假手术组分离双侧颈总动脉后不夹闭血管，也不应用硝普钠降压，余同模型组。造模1 d后训练组开始进行气味训练，此后分别于3、7、14、21 d处死取材。

1.2气味穿梭训练 建模成功1 d后开始进行气味穿梭训练，实验条件刺激为乙酸异戊酯气味，非条件刺激为电击。造模成功的大鼠需要在穿梭箱内进行暗适应，适应10 min后开始气味刺激，刺激气味使大鼠闻到后逃向穿梭箱另一侧，如果未逃向穿梭箱另一侧则在箱底给予电刺激，电流为5～10 mA，大鼠逃离到穿梭箱底另一侧后电流停止，否则箱底持续受通电5 s。等待刺激气味散去后开始下一轮训练，每次穿梭训练进行20次上述训练。

1.3行为学评分 大鼠造模完成后先进行模型筛选，按照Zea Longa评分标准进行神经行为学评分，0分：无神经功能损伤；1分：大鼠前爪不能完全伸展；2分：大鼠行走时向两侧晃动；3分：大鼠行走时身体向两侧倾倒；4分：不能行走，存在意识丧失。0分和4分为建模失败被剔除，实验过程中保持各亚组均为6只大鼠。

1.4BNDF和NGF含量的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 取各组大鼠脑组织进行ELISA检测，先应用1%戊巴比妥钠过量麻醉，快速断头冰上取脑，剥离大鼠大脑双侧皮质，冰生理盐水冲洗，用滤纸吸干后称重，保存在-80度。每组取缺血脑组织，加入生理盐水制成10%的大鼠脑组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液待用。可保存于-80℃冰箱内待测。按照说明书进行ELISA法检测各组大鼠脑组织BNDF和GDNF的含量。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 造模3 d后，取各组大鼠海马组织，HE染色法镜下观察大鼠海马组织学改变。

1.6CXCR4和β-catenin的Western印迹法检测 首先取各组大鼠海马组织，20 mg海马组织加入200 μl裂解液，快速剪碎组织，冰上裂解半小时，充分裂解后4℃离心12 000 r/min,10 min，取上清液。先测定蛋白浓度确定上样量。电泳分离蛋白恒压80 V 1.5～2.0 h，转膜恒压70 V转 2 h，牛奶室温封闭40 min，一抗(CXCR4 1∶200或β-catenin 1∶200)4℃孵育过夜，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，二抗25℃孵育2 h，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，采用超敏化学发光试剂。曝光2～5 min后保存图片，应用Image J软件对目的蛋白条带进行灰度值测定，检测各组大鼠脑组织CXCR4和β-catenin的表达情况。

1.7统计学处理 采用SPSS12.0进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1HE染色评估组织学改变 假手术组脑组织结构清晰，神经元排列整齐、数量密集；模型组的细胞肿胀，分布不均，细胞周围的间隙变宽，神经元变性；相较于模型组，通过气味穿梭箱训练后海马组织神经元存活的数量增多，神经元的肿胀减少，细胞形态有显著改善(图1)。

图1 HE染色检测各组缺血再灌注3 d海马组织学改变(×400)

2.2BNDF和NGF含量 与假手术组比较，其余两组脑组织中BNDF和NGF含量明显增加(P<0.05)。与模型组比较，训练组脑组织BNDF和NGF含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑缺血后脑组织中BNDF和NGF含量

2.3气味训练对CXCR4的影响 假手术组海马组织仅见CXCR4微量表达。模型组7 d时，缺血海马CXCR4表达较前明显增多，之后随着缺血再灌注后时间延长CXCR4表达呈减少趋势。 训练组与模型组比较，3、7、14、21 d CXCR4表达均明显增多(P<0.05)。见图2，表2。

2.4气味训练对β-catenin的影响 假手术组海马组织β-catenin有微量表达。模型组7 d、14 d β-catenin含量较3 d显著增加，21 d β-catenin较14 d显著下降(P<0.05)。训练组3、7、14、21 d β-catenin表达均较模型组显著增加(P<0.05)。模型组3、7、14、21 d β-catenin表达较假手术组显著增加(P<0.05)。见图2，表2。

图2 Western印迹法检测缺血再灌注海马CXCR4和β-catenin的表达

表2 各组脑缺血后不同时间海马组织CXCR4及β-actenin表达的光密度值

3 讨 论

血管性痴呆VD是由一系列脑组织缺血和缺氧引起的痴呆综合征，以智力减退、表情冷漠、性格和情绪转变为主要临床表现〔8，9〕。本研究表明，气味穿梭箱训练可以降低训练组大鼠的神经行为学评分，可以提高BNDF和GDNF在脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中的含量。由此可以推测，气味穿梭训练可以通过提高BDNF的表达从而发挥对于缺血脑组织保护的作用。

CXCR4是基质细胞衍生因子(SDF)-1的唯一受体，是由352个氨基酸构成的具有七跨膜 G 蛋白耦联受体。主要表达于外周血淋巴细胞、树突细胞、神经元及血管内皮细胞等。CXCR4参与体内多种生理和病理机制，包括参与胚胎发育、造血功能、人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 侵染和肿瘤增殖侵袭等。研究发现敲除小鼠SDF-1 或 CXCR4 基因后，在个体发育过程中颗粒细胞分布在小脑的异位位置和海马齿状回的形态发生改变；SDF-1/CXCR4 轴是形成大脑皮层的γ-氨基丁酸(GABA)中间神经元的募集者〔10〕。研究发现CXCR4 的表达在体外和体内均可被微小RNA-9抑制，通过调控CXCR4表达抑制 Wnt/β-catenin 信号通路进而抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖，说明SDF-1/CXCR4信号通路影响Wnt/β-catenin通路并起重要作用〔11〕。

Wnt/β-catenin 信号通路在神经再生领域里起重要作用。在干细胞表面Wnt 蛋白信号和Frizzled受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRPs)的结合，通过召集基因转移酶(KAT3)的活化因子环磷腺苷应答元件结合蛋白(CREB)锚定蛋白(CBP)激活转录因子 β-catenin 的转录，从而促进干细胞分化相关基因的表达〔12，13〕。

研究表明〔14〕，模型组大鼠缺血再灌注后第3 d海马神经干细胞数开始增加，随着再灌注后时间的延长逐渐增多，在缺血再灌注后的第7天时神经干达到高峰，随后又慢慢减少，表明血管性痴呆大鼠海马可以新生神经元。大鼠脑缺血再灌注后时间的增加，CXCR4 7 d持续高表达水平，β-catenin的表达逐渐增加，在14 d时表达水平最高。CXCR4和β-catenin的表达具有时间依赖性，分析内源性神经干细胞增殖进程，说明这两种蛋白在神经干细胞增殖中都起到了调控作用。另外，本次实验还观察气味穿梭箱训练对于大鼠脑缺血再灌注后CXCR4和β-catenin表达的影响。从实验数据可以得出结论，与模型组相比，训练组大鼠海马CXCR4和β-catenin表达明显增加，从另一方面探讨气味训练对神经干细胞增殖分化的作用机制。