不同非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵对脆红李酒品质的影响

张曼，钟涛，魏雪，阚建全，武运，FERENC Hegyi，杜木英*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(中匈食品科学合作研究中心，重庆，400715)3(新疆农业大学 食品科学与药学学院， 新疆 乌鲁木齐，830052)4(匈牙利国家农业研究和创新中心食品科学研究所，匈牙利 布达佩斯，H-1022)

脆红李是中国李选育的晚熟品种，主要种植于西南地区[1]。脆红李口感爽脆，营养丰富，酚类物质含量高，具有较强的抗氧化作用[2]。果酒是近年来水果精深加工的主要方向之一，具有酒精含量低、风味独特、营养价值高等特点，深受消费者的青睐。果酒的口感和香气与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)密不可分[3]。

目前市面上尚无李子专用酿酒酵母，李子酒多采用商业酿酒酵母酿造。在使用商业酿酒酵母的同时会给李子酒带来风味同质化、果香不突出、缺乏典型性等问题[4]，从而导致产品经济效益下降。越来越多的研究表明采用非酿酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)与酿酒酵母混合发酵能够丰富果酒香气，提高果酒品质。LI等[5]发现戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)与S.cerevisiae混合发酵树莓酒，能够增加挥发性酯类、萜类和酮类物质；尤雅等[6]发现扁平云假丝酵母(Candidahumilis)与S.cerevisiae混合发酵葡萄酒，不仅降低了乙醇含量还能提高β-大马士酮的含量。目前，混合发酵的研究对象多集中在葡萄酒，而关于其在李子酒方面的研究鲜少。刘晓柱等[7]发现异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)与S.cerevisiae混合发酵空心李果酒，能够降低果酒总酸,但对酒体香气提升不明显。因此，筛选出适宜的非酿酒酵母与S.cerevisiae混合发酵对脆红李果酒的开发具有积极意义。

本文比较分析了4株常见非酿酒酵母包括热带假丝酵母(Candidatropicalis)、东方伊萨酵母(Issatchenkioorientalis)、美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)与商业酿酒酵母D254混合发酵的脆红李酒在发酵速率、理化指标、有机酸、挥发性成分及感官品质的差异，以期为生产优质脆红李酒提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验原料为脆红李，2020年9月购于本地超市。将脆红李洗净后打浆，经双层无菌纱布过滤后放置于-20 ℃冰箱保藏备用。使用前在室温下自然解冻，解冻后的脆红李汁基本化学成分为初始糖度10.9 °Brix，总酸(以苹果酸计)6.58 g/L，pH 3.34。

菌株：热带假丝酵母(C.tropicalis，CICC 31006)、东方伊萨酵母(I.orientalis，CICC 32163)、美极梅奇酵母(M.pulcherrima，CICC 32434)，中国工业微生物菌种保藏管理中心；葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)，本实验室保存；商业酿酒酵母D254，法国Lallemand公司。

蔗糖(食品级)，市购；YPD培养基，青岛海博生物技术有限公司；3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠(分析纯)，成都科龙化工试剂厂；有机酸标准品，索莱宝生物科技有限公司；无水乙醇、2-辛醇标准品，上海阿拉丁生化股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PH-100笔式酸度计，上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV-1240紫外分光光度计、GC2010气相色谱仪、LC-20A高效液相色谱仪、GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 混菌发酵试验

脆红李汁解冻后，添加蔗糖调整其初始糖度为20 °Brix，然后进行巴氏灭菌(70 ℃，15 min)，检验灭菌效果[8]。提前将发酵菌株接种于YPD培养基中活化，经摇床培养(28 ℃，180 r/min) 24 h后离心收集菌体，经无菌水洗涤2次后接入100 mL脆红李汁中。非酿酒酵母接种量为107CFU/mL，酿酒酵母的接种量为106CFU/mL，接种方式为顺序接种，即先接种非酿酒酵母，48 h后再接种酿酒酵母，以酿酒酵母单独发酵为对照。发酵在带橡胶塞和立式发酵栓的250 mL 锥形瓶中进行，(20±1)℃下静置发酵。通过每天测定CO2失重量监测发酵进程[9]。主发酵结束后加入50 mg/L SO2，经8 000 r/min，10 min离心后弃菌体，上清液用于后续分析。

1.3.2 基本理化指标测定

pH采用pH计测定；酒精度、总酸、挥发酸参照GB/T 15038—2006测定，其中酒精度采用气相色谱法[10]测定，总酸和挥发酸采用氢氧化钠滴定法测定；还原糖采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[11]；色度和色调采用比色法[12]，色度=A420nm+A520nm+A620nm，色调=A420nm/A520nm。

1.3.3 有机酸含量测定

有机酸的测定参照李玉珠等[13]的方法。

1.3.4 挥发性成分测定

挥发性成分测定参考LU等[14]的方法。

1.3.5 感官分析

采用定量描述分析法对脆红李酒的香气成分进行评价。8位经过培训的感官品评员(4男4女)依次根据经前期讨论确定的感官描述词(果香、花香、乙醇味、脂肪味、酸味)按照5点标度法对酒样进行打分，0～5分表示感觉强烈程度逐渐增大。

1.3.6 数据分析

利用SPSS 19.0对数据进行方差分析，采用Duncan检验进行多重比较。分别采用Origin 2018和SMICA 14.0进行绘图和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 发酵动力学曲线

如图1所示，酿酒酵母单独发酵的发酵速率比与非酿酒酵母混合发酵的速率更快，对照组Sc在第10天完成主发酵过程，而实验组需要12～13 d才能完成主发酵过程，延缓了发酵进程，这是非酿酒酵母的发酵能力相对较弱的体现[15]。在初始发酵阶段(前2 d)Sc起酵速度更快，其次是C.tropicalis和I.orientalis，而M.pulcherrima和H.uvarum相对较慢。非酿酒酵母单独发酵48 h后接种酿酒酵母，其发酵速率明显上升，说明Sc在酒精发酵过程中起主导作用。发酵结束后，对照组Sc释放9.63 g CO2，混合发酵实验组释放8.63～9.18 g CO2，其中Hu-Sc释放的最多。

图1 发酵动力学曲线Fig.1 Fermentation kinetics (CO2production) of the mixed and pure fermentations

2.2 混合发酵对脆红李酒理化指标的影响

由表1可知，发酵结束后，各酒样酒精度分别下降了6.77%、7.31%、4.11%、3.05%，可能是非酿酒酵母消耗了部分糖用于风味物质形成[16]。各酒样挥发酸均符合GB 15037—2006规定(<1.2 g/L)，其中Io-Sc挥发酸含量相对较高，说明该株I.orientalis产挥发酸的能力较强，张文文等[17]也曾发现相同结果。颜色是脆红李酒的重要感官品质之一，与消费者的接受程度密切相关[18]。除Mp-Sc外，其余混合发酵酒样的色度和色调与对照组均存在显著性差异，说明混合发酵能够显著影响果酒颜色。Mp-Sc中红色成分(A520nm)含量较高，可能是由于M.pulcherrima能够促进红葡萄酒色素的稳定[19]，也可能是因为该株M.pulcherrima能够产生红色色素。

表1 脆红李酒的基本理化指标Table 1 Physio-chemical indicators of Cuihongli plum wines

2.3 混合发酵对脆红李酒有机酸的影响

有机酸的种类和含量是影响脆红李酒风味品质的重要因素。与Sc单独发酵相比，混合发酵对脆红李酒中大多有机酸影响显著，且不同菌株之间存在差异。混合发酵后脆红李酒中的苹果酸含量显著降低，表明4株非酿酒酵母均具有良好的苹果酸降解能力[20-21]，其中Io-Sc下降幅度最大，苹果酸降解率达到35.1%。苹果酸含量的减少有利于削弱尖锐的生青味和涩味[22]。乳酸含量也显著降低，适量乳酸能赋予酒体酸度柔和、圆润，更利于酒体的稳定[23]。一般认为乙酸含量在0.20～0.70 g/L能够增加果酒风味复杂性，超过0.80 g/L则会带来苦味和醋酸味。Hu-Sc与Sc的琥珀酸含量无明显差异，这与WEI等[24]报道H.uvarum能够降低琥珀酸的结论不一致，可能与实验原料和所用菌株有关。酒石酸和柠檬酸变化不显著。

表2 脆红李酒中有机酸含量 单位：g/L

2.4 混合发酵对脆红李酒挥发性成分的影响

如表3所示，主发酵阶段结束后从脆红李酒中共检测到28种挥发性成分，包括8种醇类、10种酯类、5种酸类、2种萜烯类以及3种其他物质。与Sc组(16种)相比，混合发酵(23、18、20、19种)获得的香气成分种类更多，说明发酵时间的延长能够对脆红李酒的风味多样性发挥积极作用。

表3 脆红李酒中挥发性成分的含量Table 3 Contents of volatile components in Cuihongli plum wines

高级醇是酒精发酵阶段形成的主要副产物之一，当其含量低于300 mg/L时能够增加果酒香气复杂性[25]。在脆红李酒的香气组成中，醇类化合物含量最高，从5种脆红李酒中分别检测到8、5、6、6、5种高级醇，其中Ct-Sc组高级醇含量最高，其余样品中高级醇的含量均低于Sc组。与对照组相比，混合发酵脆红李酒的异丁醇含量显著增加(除Io-Sc外)，但未达到其感觉阈值，所以不会增加果酒的生青味。异戊醇是脆红李酒中含量最高的醇类物质，能够赋予酒样白兰地或辛辣味，但超过一定范围后也会对脆红李酒的风味有不良影响。在Mp-Sc组中，苯乙醇和(E)-3-己烯-1-醇的含量显著增加，增幅分别达到12.40%和119.00%。苯乙醇能够为脆红李酒带来玫瑰、蜂蜜等香气，(E)-3-己烯-1-醇能够为脆红李酒带来青草香。

酯类物质是果酒特征香气成分之一，通常可以赋予葡萄酒一定的花香、果香。5种脆红李酒的酯类物质种类分别为9、6、8、9和7种，其中Io-Sc酯类含量最高，达到2 255.61 μg/L，乙酸乙酯是该样品最主要的酯类物质，占比超过90.00%，并且仅有乙酸己酯的香气活度值(odor activity value，OAV)>1，可推断该酒样香气在组成上不协调。主发酵结束后，各实验组的酯类含量分别是对照组的1.22、4.12、3.59、1.81倍。具体体现在乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、水杨酸甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯的含量显著提升，其中辛酸乙酯(花香、香蕉)、癸酸乙酯(果香、花香)、月桂酸乙酯(脂肪、果香)的OAV>1，对脆红李香气贡献更为显著。

果酒中的脂肪酸主要来源于酵母菌和乳酸菌代谢，低浓度时散发奶酪、奶油的风味，浓度过高则会带来醋酸味、刺激味和腐败味[26]。在本实验中共检测到5种酸类，其中乙酸和辛酸为共有成分，乙酸的产生与维持细胞内氧化还原平衡密切相关[27]，辛酸是酵母发酵过程中合成细胞膜所需长链脂肪酸的剩余片段[28]。2-甲基丁酸仅在Io-Sc组被检出，且其含量超过阈值(OAV>1)，会带来酸味、干酪等不良气味。总体而言，混合发酵后，酸类物质总量显著降低，其带来的不良影响降低，更有利于脆红李酒香气的平衡。

萜烯类化合物香味浓郁，感官阈值低，对果酒香气成分的有较大贡献。在Sc与Hu-Sc2组中未检测到萜烯类物质，其余样品中均含有芳樟醇，且在Ct-Sc和Mp-Sc2组中芳樟醇OAV>1，能够明显赋予脆红李酒花香。这一结果表明C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima3种菌株可能具有相对较高的糖苷酶活性，能够让以糖苷结合态形式存在的香气物质转变为游离态。除此之外，Ct-Sc中还检测到香茅醇，可为脆红李果酒提供玫瑰花香和甜香。

在酒样中还检测到了2,4-二叔丁基、3-甲硫基丙醇、1-庚烯，对丰富脆红李果酒风味的复杂性有一定的贡献。混菌发酵后，带有生土豆味、脂肪味的3-甲硫基丙醇含量明显减少。

2.5 主成分分析

一般认为，OAV>1的香气物质是果酒的主要呈香物质。近年来，也有研究表明OAV>0.1 的香气物质可作为潜在呈香物质，它们可以通过叠加与其类似的香气化合物从而对果酒香气产生积极效果[29]。为了直观分析4种不同混合发酵脆红李酒的香气差异，对表3中OAV>0.1的12种香气成分进行主成分分析。由图2可知，前2个主成分累计方差贡献率>80.00%，包含了原样本中绝大多数信息。由(图2-a)可知，5种脆红李酒在置信区间内区分明显，且混合发酵与对照组Sc都不在同一象限内，说明混合发酵能够显著影响脆红李酒的风味。Ct-Sc与Hu-Sc位于同一象限且距离较近，说明在风味上具有一定的相似性， 与二者相关性强的挥发性成分是异戊醇。与Io-Sc相关性较强的挥发性成分是2-甲基丁醇和乙酸乙酯。与Mp-Sc组相关性强的挥发性成分主要包括了辛酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇等，赋予脆红李酒果香和花香。而Sc组与辛酸、2,4-叔丁基苯酚、棕榈酸乙酯等的相关性较强，在增加风味多样性的同时也带来了不良风味。

a-主成分得分图；b-载荷图图2 酒样中OAV>0.1的香气化合物的主成分得分图 和载荷图Fig.2 PCA score map and load map of volatile aroma compounds (OAV>0.1) in wine samples

2.6 感官评价

不同混合发酵的脆红李酒感官评价雷达图见图3。由图3可知，Mp-Sc组的果香和花香得分明显高于Sc组，这是因为M.pulcherrima与S.cerevisiae混合发酵后显著增加了脆红李酒中酯类物质和萜烯类物质的含量，可赋予果酒香气多样性和复杂性。Io-Sc组总酯含量最高，但其体现出的果香相对较弱，这与混合酯间的组成比例密切相关[30]。Ct-Sc与Hu-Sc各项评分都较为接近，与主成分分析结果一致。在本次实验中，Ct-Sc、Hu-Sc的感官得分较低，可能与菌株接种量、接种比例、接种顺序等酿造条件有关，导致给脆红李酒风味造成负面影响。总体来看，采用Mp-Sc混合发酵脆红李酒时酒体具有较好的感官品质。

图3 感官分析雷达图Fig.3 Radar map of sensory analysis

3 结论

本实验研究了C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima、H.uvarum分别与Sc顺序接种混合发酵对脆红李酒品质的影响。结果表明，与Sc单独发酵(10 d) 相比，混合发酵延缓了发酵进程(12～13 d)。不同脆红李酒的基本理化均符合国标，但Io-Sc中挥发酸含量较高，达到0.78 g/L。除Mp-Sc外，混合发酵对脆红李酒的色度和色调有显著影响。经混合发酵后脆红李酒中的苹果酸、乳酸和乙酸含量显著降低，有利于果酒风味平衡。在香气方面，Mp-Sc中辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇显著提高，有利于增强酒体果香、花香。感官评价结果表明Mp-Sc的果香味和花香味较为浓郁，而Ct-Sc与Hu-Sc风味相对较弱，可能与酿造条件有关。综上，M.pulcherrima更适合应用于混菌酿造脆红李酒，有利于增加香气复杂性，提升品质。后续课题组将会进一步对接种量、接种比例、接种顺序等工艺参数进行优化，为生产优质的脆红李酒提供参考依据。