受体交互作用蛋白激酶1抑制剂necrostatin-1治疗狼疮性肾炎的实验研究

朱 妍 彭 琳 张明超 王荔枝 徐孝东 曾彩虹 秦卫松 刘志红

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)的常见临床表现,是我国常见的继发性肾小球疾病之一,也是患者死亡的主要原因,约10%的LN患者最终发展为终末期肾病(ESRD)[1-2]。LN的致病机制尚不明确,绝大多数LN患者肾脏中可见免疫球蛋白和补体成分沉积于肾小球和肾小管,伴内皮细胞、系膜细胞和基膜损伤等[3]。目前以激素和免疫抑制药物联合治疗为主,除了贝利木单抗(一种B淋巴细胞刺激因子的特异性抑制剂),其他生物制剂和小分子靶向抑制剂仍有待研发[4]。坏死性凋亡是一种新发现的程序性细胞坏死,与凋亡不同,坏死性凋亡细胞会释放细胞内容物,激活巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞,导致免疫和炎症反应[5]。肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)介导的坏死性凋亡是最广泛最常见的途径,其中受体交互作用蛋白激酶(RIPK)1作为分子平台,参与多条信号通路[6]。RIPK1去泛素化时激活依赖半胱氨酸蛋白酶(caspase)的促凋亡级联反应,当caspase8受抑制时,RIPK1、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)共同形成坏死小体,此时MLKL磷酸化,插入胞膜,破坏细胞膜完整性,导致细胞发生坏死性凋亡[7]。necrostatin-1(Nec-1)是经典的RIPK1小分子抑制剂,已在多种动物模型中得到了广泛验证[8]。本研究借助LN样小鼠和体外系膜细胞,观察Nec-1治疗LN的疗效。

材料与方法

主要试剂与仪器磷酸化(S166)RIP1抗体(美国CST公司),RIP1抗体(美国CST公司),磷酸化(S358)MLKL抗体(美国Abcam公司),MLKL抗体(美国CST公司),Nec-1(Selleck公司),流式细胞仪(型号 FACS ARIA)。

实验对象和分组实验动物 MRL/lpr小鼠13只,雌性,SPF级,购自南京模式动物所,放置于东部战区总医院SPF级动物房进行饲养,正常饮食,采用明暗各12h照明。本课题中所有动物的使用均已获得东部战区总医院伦理委员会批准。第19周龄MRL/lpr小鼠平均体质量30±2.5g,随机分成两组(7例、6例),分别腹腔注射Nec-1[3.5 mg/(kg·d)]和同等剂量溶剂,共计21d。于第19、20、21和22周收集小鼠尿液,第22周后麻醉处死,收取小鼠血液和肾脏标本(每组各5例)。

建模细胞人系膜细胞,购自美国标准生物品收藏中心(American type culture collection,ATCC)。采用含10%FBS,青霉素-链霉素各100 U/ml的DMEM低糖培养基,37℃培养3～4天后进行相关研究。分成NC组、T/S/Z组、Nec-1组和CTL-N组。分组用100 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)重组蛋白(PeproTech公司)、50μmol/L Z-VAD-FMK(MCE公司)、50 nmol/L SM-164(Selleck公司)诱导细胞坏死性凋亡,Nec-1处理细胞。

血清肌酐和尿素氮检测取干净的96孔板,加入稀释的标准品和小鼠血清样本。按酶联免疫吸附测定试剂盒(Bio Assay Systems公司)步骤操作。

血清抗核抗体(ANA)和抗双链DNA(dsDNA)抗体检测分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。按照小鼠抗dsDNA抗体和ANA酶联免疫分析试剂盒步骤操作。

尿蛋/白肌酐比值测定收集基线和给药处理3周的尿样本,置于-80℃保存,用Bradford法(天根公司)测定尿总蛋白。计算尿蛋白/肌酐比值,绘制曲线。

PAS染色制备好的肾脏切片放入乙醇固定10 min,蒸馏水冲洗,晾干。10g/L高碘酸氧化20 min,蒸馏水冲洗,晾干。置于Schiff溶液中室温染色30～60 min。用亚硫酸溶液冲洗3次,2 min/次,蒸馏水冲洗,晾干。20 g/L甲绿复染20 min,水洗,晾干。中性树脂封片,镜下拍照。

肾小球病理评分每张肾组织切片中随机选取20个小球的横切面(gcs),每个小球按下列半定量的方式评分:0=正常(35～40细胞/gcs);1=轻度,小球少量病变表现为轻度增殖性病变和轻度细胞增殖(41～50细胞/gcs),伴或不伴轻微渗出;2=中度,中度细胞增生(51～60细胞/gcs),包括节段和(或)弥漫性增殖性病变,透明性变和中度渗出;3=重度,节段和(或)全球硬化,伴或不伴重度细胞增生(>60细胞/gcs)、坏死、新月体形成和重度渗出。

免疫荧光染色取冰冻切片,通风橱放置30 min去除水汽。正常山羊血清封闭液滴在切片上,室温放置封闭1h。轻甩玻片,擦去多余的封闭液。用抗体稀释液稀释一抗(1∶100),覆盖切片组织,4 ℃孵育过夜。PBS缓冲液,稀释相应抗一抗种属来源的二抗(1∶200),滴加在玻片上,避光室温孵育1h,PBS冲洗3次,2 min/次。避光晾干后,滴加含有DAPI的抗淬灭剂封片,干片后4℃保存。

WesternBlot检测坏死性凋亡相关分子表达提取组织和细胞蛋白质,BCA法测定蛋白浓度,根据蛋白定量结果,计算含20 μg蛋白的溶液体积即为上样量。在经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上,以5%脱脂牛奶封闭1h,TBST洗膜3次,5 min/次;加入对应抗体,4℃孵育过夜。TBST洗膜,加入浓度为1∶5 000的IgG-HRP的二抗室温孵育1h,TBST洗膜。ECL检测样本免疫活性,凝胶成像系统分析,Image J软件得出灰度值。

qRT-PCR检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6、TNF-α的表达水平收集系膜细胞,按RNA提取试剂盒(ZYMO Research公司)提取总RNA,并用Nanodrop测定纯度和浓度,使用逆转录试剂盒进行DNA的合成。引物为IL-1β:5′-CCACAGACCTTCCAGGAGAA TG-3′和5′-GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG-3′。IL-6:5′-CCAGCTATGAACTCCTTCTC-3′和5′-GCTTG TTCCTCACATCTCTC-3′。TNF-α:5′-CTCTTCTGCCT GCTGCACTTTG-3′和5′-ATGGGCTACAGGCTTGTC ACTC-3′。参照物GAPDH:5′-GTCTCCTCTGACTT CAACAG CG-3′和5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGC CAA-3′。qRT-PCR使用SYBR Green法,PCR热循环条件:95℃ 30s预变性,95℃ 5s、60℃ 1 min的热循环,共40次;仪器为ABI 7900HT Fast Real time System。读取临界循环数进行记录分析。以正常对照细胞为矫正样本,用比较阈值法计算目的基因的相对含量。

细胞活性检测在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)。将培养板放在37℃培养箱中预培养。待细胞快长满孔板,按不同分组加入药物处理,每组6个复孔,处理24h。于培养箱中取出待测细胞培养板,室温放置30 min,以使培养板温度平衡至室温。加入与待测细胞等体积(100 μl)并平衡至室温的细胞活力检测试剂Cell Counting-Lite 2.0(Promega公司),振荡混匀5 min使细胞充分裂解。室温放置10 min以稳定发光信号,使用多功能酶标仪检测荧光素酶信号。整理数据,分析结果。

流式细胞术系膜细胞分组,加不同的处理药物。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞,离心弃上清。按照经典膜联蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)双染细胞凋亡检测试剂盒步骤进行操作。1h内上流式细胞仪检测。

统计学方法统计数据以均数±标准差表示,数据应用《Prism8》软件(GraphPadSoftware)进行分析,两组间比较t检验分析,多组间比较采用单因素方差分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

Nec-1缓解MRL/lpr小鼠的自身免疫炎症反应我们用Nec-1和对照溶剂处理19周龄的MRL/lpr小鼠,3周后通过ELISA检测血清学指标。结果提示,和对照组相比,Nec-1处理的小鼠血清ANA(图1A)和抗dsDNA抗体滴度显著降低(图1B)。

图1 Nec-1降低狼疮样小鼠的血清ANA(A)和抗dsDNA抗体(B)水平ANA:抗核抗体；抗dsDNA抗体：抗双链DNA抗体；Nec-1:necrostatin-1

Nec-1可缓解MRL/lpr小鼠的肾脏损伤对照组小鼠尿蛋白/肌酐比值随着周龄增加呈进行性增高,Nec-1处理的LN小鼠,尿蛋白/肌酐比值明显降低,治疗3周后两组间具有统计学差异(图2A)。同时, Nec-1处理组小鼠血清肌酐和尿素氮水平也显著下降(图2B、C)。Nec-1治疗组病理表型良好，增殖性病变和渗出较轻，肾小球病理评分明显低于对照组(图2D)。免疫荧光结果提示,Nec-1处理组小鼠肾小球IgG、C3沉积减少(图2E)。PAS染色结果提示,与对照组相比,Nec-1组肾小球增生硬化程度降低,间质细胞浸润减少(图2F)。

图2 Nec-1缓解狼疮性肾炎小鼠的肾脏损伤Nec-1:necrostatin-1;A:对照组和Nec-1组尿蛋白/肌酐比值;B:对照组和Nec-1组血清肌酐水平;C:对照组和Nec-1组血清尿素氮水平;D:肾小球病理评分；E:Nec-1处理组小鼠C3、IgG沉积减少(IF，×400);F:Nec-1组肾小球硬化程度降低，间质细胞浸润减少(F1～2：PAS,×200，E3～4:PAS,×400)

Nec-1抑制狼疮性肾炎小鼠系膜细胞的坏死性凋亡通路表达提取小鼠肾皮质总蛋白,Western Blot结果显示和对照组相比,Nec-1处理组磷酸化RIPK1与非磷酸化RIPK1的比值降低,磷酸化MLKL与非磷酸化MLKL的比值也降低(图3A),提示坏死性凋亡信号通路受到抑制。将系膜细胞与坏死性凋亡相关分子进行免疫荧光共染,结果提示,LN小鼠系膜细胞高表达磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL,而Nec-1处理组磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL表达下调(图3B、C)。

图3 Nec-1抑制LN小鼠肾脏坏死性凋亡通路相关分子表达RIPK1:受体交互作用蛋白激酶1;MLKL:混合谱系激酶结构域样蛋白；LN：狼疮性肾炎；Nec-1:necrostatin-1;PDGFR-β:血小板来源生长因子受体β;P-RIPK1：磷酸化RIPK1；P-MLKL：磷酸化MLKL；A:Western Blot检测P-RIPK1和P-MLKL分子表达;B:免疫荧光染色观察系膜细胞标志物PDGFR-β和P-RIPK1(IF，×400);C:免疫荧光染色观察系膜细胞标志物PDGFR-β和P-MLKL(IF，×400)

Nec-1降低体外人系膜细胞坏死性凋亡相关蛋白的表达通过TNF-α、SM-164、Z-VAD-FMK共刺激体外系膜细胞,可有效诱导细胞坏死性凋亡。采用10 μmol/L Nec-1按照时间梯度处理6h、12h、24h,观察到24h磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表达显著降低(图4A)。另一方面,以不同浓度(1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L)Nec-1处理细胞24h,均可显著降低磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表达(图4B),提示Nec-1有效抑制系膜细胞的坏死性凋亡相关分子的表达(图4B)。

图4 Nec-1抑制RIPK1依赖的坏死性凋亡通路T:TNF-α，肿瘤坏死因子α;S:SM-164;Z:Z-VAD-FMK;RIPK1:受体交互作用蛋白激酶1;MLKL:混合谱系激酶结构域样蛋白；Nec-1:necrostatin-1;P-RIPK1:磷酸化RIPK1;P-MLKL:磷酸化MLKL;A:Western Blot显示Nec-1处理24h后P-RIPK1和P-MLKL的蛋白表达情况;B:Western Blot显示1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L Nec-1处理系膜细胞24h后P-RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表达情况

Nec-1有效抑制细胞发生坏死性凋亡Nec-1处理细胞24h时,ATP含量最多,提示细胞坏死性凋亡受到抑制(图5A)。不同浓度Nec-1处理均可有效阻断细胞坏死性凋亡过程(图5B)。既往研究表明[9],发生坏死性凋亡的细胞可与Annexin V结合。流式细胞分析结果显示,与诱导坏死性凋亡组相比,Nec-1处理组Annexin V+/PI+的细胞和Annexin V+/PI-的细胞数量均显著减少,说明Nec-1对细胞程序性死亡具有显著抑制作用(图5C)。

图5 Nec-1有效抑制细胞发生坏死性凋亡Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α,肿瘤坏死因子α;S:SM-164,;Z:Z-VAD-FMK;NC：对照组；Nec-1组:Nec-1处理坏死性凋亡组；CTL-N组：Nec-1处理对照组；A:检测Nec-1处理系膜细胞6h、12h、24h后细胞活性变化;B:1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L Nec-1处理后细胞活性变化;C:流式细胞检测细胞不同时期凋亡

Nec-1下调系膜细胞IL-1β和IL-6的表达通过诱导体外培养的系膜细胞发生坏死性凋亡,提取RNA进行qRT-PCR,结果显示,发生坏死性凋亡的系膜细胞IL-1β和IL-6的表达增高,给予10μmol/L Nec-1处理24h后IL-1β和IL-6 mRNA的表达显著下调(图6A、B)。另外,TNF-α的mRNA表达无明显变化,且Nec-1无明显抑制作用(图6C)。以上结果提示,RIPK1抑制剂Nec-1对体外系膜细胞坏死性凋亡过程中产生的促炎因子具有抑制作用。

图6 Nec-1下调系膜细胞中IL-1β和IL-6 mRNA的表达Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α,肿瘤坏死因子α;S:SM-164;Z:Z-VAD-FMK;IL:白细胞介素;CTL-N组：Nec-1处理对照组;NC:对照组;A:qRT-PCR显示坏死性凋亡过程中IL-1β mRNA的表达变化;B:qRT-PCR显示坏死性凋亡过程中IL-6 mRNA的表达变化;C:qRT-PCR显示坏死性凋亡过程中TNF-α mRNA的表达变化

讨 论

坏死性凋亡在多种自身免疫性疾病和肾脏疾病中发挥着重要作用[10-11]。研究发现,在SLE患者的B细胞中观察到坏死性凋亡的增加[12]。Sarhan等[13]发现SLE中干扰素信号增强,进一步放大坏死性凋亡,为自身免疫过程中病理性干扰素与组织损伤之间提供了关联。另外,SLE患者外周血单个核细胞中的MLKL mRNA表达上调,而与未合并LN的患者相比,发现LN患者的MLKL mRNA上调,并且处于疾病活动期的患者也高于疾病稳定患者[14]。开发坏死性凋亡调控过程中关键蛋白的分子抑制剂,是抑制疾病进程中坏死性凋亡发生的有效方式。本研究探讨了LN小鼠系膜细胞中RIPK1和坏死性凋亡通路的激活,发现RIPK1抑制剂Nec-1能有效阻断小鼠系膜细胞坏死性凋亡信号通路,减轻LN小鼠的全身免疫炎症反应,同时显著缓解肾脏损伤。表现为LN小鼠ANA和抗dsDNA抗体滴度下降,尿蛋白降低,血清肌酐、尿素氮水平显著下降,肾脏C3、IgG沉积减少,肾小球增殖性病变和硬化程度减轻,细胞浸润减少,证实了Nec-1治疗LN的疗效。

系膜细胞是特殊的平滑肌细胞,不仅合成和分泌细胞外基质,还起到吞噬和分泌多种促炎症因子和生长因子的作用[15]。在LN中,循环的抗dsDNA抗体可与系膜细胞结合,引起纤维化、炎症、凋亡等反应,染色质堆积形成的电子致密物进一步扩大免疫炎症反应[16]。一项研究报道,LN患者抗dsDNA抗体和肾小球细胞增殖和凋亡呈高度相关,提示抗dsDNA抗体可诱导体内系膜细胞增殖与凋亡[17]。而利用抗dsDNA抗体刺激体外人系膜细胞,可以增加IL-1β、IL-6 和TNF-α的分泌[18-19]。本研究在体外系膜细胞中激活坏死性凋亡通路,验证了Nec-1可抑制其相关分子的表达,阻断系膜细胞坏死性凋亡,维持细胞活性,减少促炎因子的表达。

综上所述,本研究结果证明RIPK1抑制剂Nec-1治疗LN小鼠具有一定疗效,提示Nec-1可能成为治疗SLE和LN的潜在小分子生物抑制剂。