基于信息熵理论的黄芪三七复方提取工艺优选△

张仕瑾，兰杨a，王娅俐，郭廷东，张燕，唐志立，谢席胜

1.川北医学院 第二临床医学院/南充市中心医院 药学部，四川 南充 637000；2.个体化药物治疗南充市重点实验室，四川 南充 637000；3.川北医学院 第二临床医学院/南充市中心医院 肾内科，四川 南充 637000

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是指各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史>3个月)[1]。我国18周岁以上的成年人群中CKD的患病率为10.8%[2]。CKD多呈进行性进展，约有2%患者会进入终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)阶段，需要通过透析或肾移植等肾脏替代治疗来维持生命[3]。中医药在慢性疾病的综合防治方面有着独特的优势，能有效改善CKD患者的生活质量，减缓CKD的进程，并能减少化学药物带来的不良反应[4]。黄芪三七复方是南充市中心医院肾内科谢席胜主任医师的临床经验方，该处方由黄芪、三七、当归、牛膝等组成，具有益气养血、活血利水、健脾助运的功效。前期基础研究表明，该复方能提高血清白蛋白水平，降低尿蛋白及血脂，调节免疫进而延缓CKD进展，提高患者生活质量[5]。本研究以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb15个组分的提取量及浸膏得率为评价指标，结合信息熵理论赋予指标客观的权重系数，计算综合评分，采用正交试验筛选最佳提取工艺参数，为后期中试及制剂生产提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器(PDA)(日本岛津公司)；MS105DU型十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多国际有限公司)；JY10002型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；UPH-1V-20T型超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 试药

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，纯度：97.6%)、阿魏酸(批号：110773-201614，纯度：99.0%)、三七皂苷R1(批号：110745-201820，纯度：93.1%)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201832，纯度：92.4%)、人参皂苷Rb1(批号：110704-201827，纯度：91.2%)均购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水；甲醇、乙腈为色谱级；其余试剂为均为分析级。

试验所用饮片均购自四川省中药饮片有限公司，经南充市中心医院药学部张燕主任中药师鉴定：黄芪(批号：180829，产自甘肃)为膜夹黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根；三七(批号：190219，产自云南)为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎；当归(批号：190104，产自甘肃)为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根；牛膝(批号：190220，产自河南)为苋科植物牛膝AchyranthesbidentataBl.的干燥根；昆布(批号：181212，产自山东)为海带科植物海带LaminariajaponicaAresch.或翅藻科植物昆布EckloniakuromeOkam.的干燥叶状体；薏苡仁(批号：190211，产自贵州)为禾本科植物薏苡仁Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁；山药(批号：190129，产自河南)为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎；甘草(批号：190212，产自新疆)为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件 色谱柱：SHIMADZU C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1% 磷酸水(B)，梯度洗脱(0～13 min，19%A，13～60 min，19%～37%A)；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；检测波长：203 nm(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1)、260 nm(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、320 nm(阿魏酸)[6-7]。

2.1.2混合对照品溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷47.2 μg·mL-1、阿魏酸101.5 μg·mL-1、三七皂苷R1111.3 μg·mL-1、人参皂苷Rg187.0 μg·mL-1、人参皂苷Rb1102.3 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 精密吸取正交试验提取液10 mL，置25 mL量瓶中，加75% 甲醇稀释，振摇，定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.4系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样分析。结果见图1，各色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子为0.93～1.05，理论板数以毛蕊异黄酮葡萄糖苷计不低于5000。

注；A.混合对照品；B.供试品；1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1；4.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5.阿魏酸。图1 混合对照品和黄芪三七复方的HPLC图

2.1.5线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得线性范围和回归方程(表1)，结果表明，各成分在进样范围内线性关系良好。

表1 黄芪三七复方中5种成分的线性范围和回归方程

2.1.6精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.76%、0.46%、0.79%、0.82%、0.69%，表明仪器精密度良好。

2.1.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、18、24 h按2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.37%、1.82%、1.07%、1.54%、0.98%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.1.8重复性试验 取同一提取液按2.1.3项下方法制备6份供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.10%、1.03%、1.21%、0.89%、0.74%，表明方法重复性良好。

2.1.9加样回收率试验 吸取已知含量的提取液5 mL 至25 mL量瓶中，平行6份，分别加入混合对照品溶液(按2.1.2项下方法制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别为0.073、0.148、0.242、0.865、0.631 mg·mL-1的混合对照品溶液)1 mL，按2.1.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表2。

表2 黄芪三七复方中5种成分的加样回收率试验结果

2.1.10浸膏率的测定 精密吸取提取液50 mL，置干燥至质量恒定的蒸发皿中(M1)，水浴蒸干，转移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速称定质量(M2)，计算浸膏率。

(1)

式中，M为处方药材总质量，V为提取液体积。

2.2 信息熵理论结合正交试验优选提取工艺

2.2.1正交试验因素水平与结果 在前期单因素试验的基础上，选择加水倍数(A)、提取时间(B)、提取次数(C)作为正交试验考察因素，每个因素3个水平，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量及干膏率的综合评分为评价指标，采用正交试验表L9(34)

进行试验，因素水平表见表3，试验结果见表4。

表3 黄芪三七复方水提取的因素水平

表4 黄芪三七复方L9(34)水提取正交试验设计与结果

2.2.2应用信息熵理论赋予指标客观权重 参考相关文献，建立评价指标的原始矩阵(X)，再将其转化成概率矩阵(P)[8-10]，结果如下。

根据概率矩阵(P)，计算各指标的信息熵(Hi)，得到：

Hi=[0.991 1 0.995 6 0.995 4 0.996 4 0.993 0 0.996 0]

根据指标的Hi，计算指标的权重系数(Wi)，得到：

Wi=[0.272 9 0.135 3 0.142 9 0.110 9 0.215 3 0.122 7]

对于具有m行n列的概率矩阵，综合评分按公式(2)计算。

Mm=P1m×W1+P2m×W2+P3m×W3+…+Pnm×Wn

(2)

2.2.3正交试验结果分析 由表4的极差分析结果(R)可知，各因素对综合评分的影响大小为C>A>B>D，由表5的方差分析结果，可知提取次数对综合评分的影响差异有统计学意义(P<0.05)。因此，确定提取工艺为A2B1C3，即加10倍量水，提取4次，每次30 min。

表5 黄芪三七复方水提取工艺参数方差分析

2.2.4验证实验 为验证工艺的可靠性，按处方比例称取4倍量药材(共644 g)，平行3份，按上述确定的工艺重复3次，依法测定各指标含量和浸膏率，结果见表6。各指标的提取量均较高，平均综合评分为0.133 7，RSD为0.94%，结果表明优选的工艺稳定可行。

表6 黄芪三七复方水提取工艺验证实验结果

3 讨论

黄芪三七复方临床主要用于治疗慢性肾脏病3～4期患者，具有益气养血、活血利水、健脾助运的功效，能使气血健旺、瘀血消散，进而使废用的肾脏得以一定程度的恢复。本方中黄芪味甘，性微温，归脾、肺经，可益气活血、升阳健脾、利水消肿为君药；三七活血化瘀兼有补血作用，当归活血养血，两者协同黄芪补血活血作用为臣药。黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷通过激活磷脂酰肌醇3-激酶和蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径减轻体内缺血再灌注损伤[11]。三七中皂苷类成分能改善微循环、抗炎、增强机体免疫力，具有抗肾间质纤维化、抗肾脏氧化损伤、保护肾脏作用[12-14]。当归中阿魏酸能保护血管内膜，具有抗动脉粥样硬化的作用。有研究表明，阿魏酸钠盐能促进大鼠肾炎症状明显改善[15]。因此，本实验选择与治疗作用相关的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1作为含量指标成分，能较全面地评价提取工艺。

前期实验中对加水倍数、提取时间、提取次数、浸泡时间进行了单因素考察，结果浸泡时间对结果几乎无影响，故将加水倍数、提取时间、提取次数作为正交试验考察因素。在建立多指标含量测定方法时，考察了等度洗脱和梯度洗脱2种方式，结果等度洗脱指标峰分离度差，且出峰时间间隔较长。同时还考察不同色谱系统如甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等。由于阿魏酸在酸性条件下峰形较好，拖尾现象能得到极大改善，最终确定乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，进行梯度洗脱，结果样品中各指标峰峰形较好，拖尾因子为0.93～1.05，分离度均大于1.5。

目前，信息熵理论在中药复方提取工艺中得到了广泛应用，该理论能很好地解决评价指标的客观赋权问题[16-17]。通过对实验数据的数理分析，指标成分在不同条件下的客观变化规律被揭示，变异程度越大、信息熵越小、提供的信息越多、权重系数越大，反之权重系数越小。本研究以5种指标成分的含量及浸膏率的综合评分为评价指标，应用信息熵理论赋予各指标客观的权重系数，实现对正交试验提取工艺参数的优选，优化后的黄芪三七复方提方提取工艺为加10倍量水，提取4次，每次30 min。该方法避免了主观因素对试验结果的干扰，使结果更客观和严谨，优化的提取工艺重复性好、稳定可靠，为该处方的进一步开发提供参考。