人脑组织库建设对阿尔茨海默病研究的意义

杜鹃 杨倩 米世雄 樊平 崔慧先 黄越

随着人口老龄化的加剧，神经退行性病变越来越严重影响人类健康，给家庭和社会造成巨大精神和经济负担。美国、欧盟、日本等发达国家纷纷启动“脑计划”以揭示大脑奥秘。我国科学家经过多年酝酿，依据科技创新2030——“脑科学与类脑研究”提出研究方向，围绕脑认知原理解析、认知功能障碍相关重大脑疾病发病机制与干预技术研究、类脑计算与脑机智能技术及应用、儿童青少年脑智发育研究、技术平台建设共五方面部署。其中，针对阿尔茨海默病的研究，以人群为主要研究对象，探讨标志物异常表征、新型发病机制、危险因素综合干预、认知功能训练平台、新型药物等，从而揭示参与阿尔茨海默病发生与发展的新机制。然而，对人脑本质性的认识往往依赖以人脑组织为材料进行的直接研究，但受限于伦理学，研究者难以通过外科手术获得正常脑组织样本，更难以获得完整脑组织。因此，建设人脑组织库（以下简称脑库），收集尸检和活检的人脑组织、采集捐献者生前疾病信息，从而为科学工作搭建平台，以直接研究疾病本体的模式揭示脑疾病的本质［1］。文献综述有助于揭示某一特定领域的研究发展历史和未来研究之趋势［2］，本文重点回顾既往3年Cell、Nature和Science等国际顶级期刊发表的人脑组织与阿尔茨海默病及相关疾病研究成果（表1），旨在综述人脑组织在阿尔茨海默病研究中的应用，以作为我国相关研究的借鉴。

表1 2018-2020年发表的人脑组织在阿尔茨海默病及相关疾病研究成果Table 1. Research on the use of human brain tissues in Alzheimer's disease and related diseases published during 2018-2020

一、研究关注点

检索美国国立医学图书馆生物医学文献数据库（PubMed）2018-2020年文题和（或）摘要同时出现阿尔茨海默病及其他关键词的文献共48 305篇，发现β-淀粉样蛋白（Aβ）、tau蛋白和病理仍为目前阿尔茨海默病研究的主题，分别为6955、5426和5006篇，各占文献总量的14.40%、11.23%和10.36%（图1）。

图1 2018-2020年PubMed中阿尔茨海默病研究所出现的关键词Figure 1 Keywords appeared in the research of Alzheimer's disease through searching PubMed limited from 2018 to 2020.

二、人脑组织研究取得的突破性进展

1.蛋白质分子生物学结构研究 2020年，美国哥伦比亚大学和梅奥诊所（Mayo Clinic）联合在Cell发表研究成果，研究者从来自梅奥诊所脑库的2例皮质基底节变性（CBD）和1例阿尔茨海默病的人脑组织中提取tau蛋白并行冷冻电子显微镜检查，通过比较二者tau蛋白纤维结构和翻译后修饰，发现tau蛋白泛素化可以修饰tau蛋白纤维之间的界面，进而提出基于结构的模型分析，建立多态tau蛋白纤维结构与神经退行性病变之间的框架［3］。同年，英国剑桥大学MRC分子生物实验室对来自其脑库的3例皮质基底节变性的人脑组织进行研究，发现其存在4R tau蛋白纤维结构［4］；该实验室还对来自剑桥大学脑库的5例多系统萎缩（MSA）和3例路易体痴呆（DLB）的人脑组织提取共核蛋白并分析其结构，发现α-突触核蛋白（α-Syn）包涵体由两种类型纤维组成，每种纤维亦由两种原纤维组成，即每种纤维中非蛋白分子均存在于两种原纤维界面上，且多系统萎缩与路易体痴呆人脑组织α-Syn蛋白丝不同［5］，这两项研究成果均发表于Nature。可见蛋白质功能由其结构决定，因此，蛋白质分子生物学结构对药物设计与研发以及疾病治疗具有重要意义。

2.单细胞转录组学研究 美国Rush大学医学中心Rush脑库接受捐献的标准是捐献者须有生前标准化临床随访资料，且这些临床资料的采集是以临床研究项目开展的。美国麻省理工学院脑与认知科学系基于信仰与Rush记忆和衰老研究（Religious Orders Study and Rush Memory and Aging Project）［6-7］对Rush脑库的人脑组织进行阿尔茨海默病单细胞转录组学研究，取材24例阿尔茨海默病和24例正常对照人脑组织的前额叶皮质，分析6种神经细胞类型，即兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质前体细胞，共获得80 660个单细胞转录组，包括与病理和特征有关的髓鞘形成、炎症反应和神经元存活的调节因子，从而认为髓鞘形成参与阿尔茨海默病的发生［8］。

3.炎症反应与tau蛋白病理发生机制研究 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体激活可导致tau蛋白病理改变［9］。德国Bonn大学医院对来自Barcelona临床医院生物样本库的9例额颞叶痴呆（FTD）和8例正常对照的人脑组织进行验证，结合转基因动物模型发现，NLRP3炎性小体激活时聚集于小胶质细胞内，促使Caspase-1和下游白细胞介素-1β（IL-1β）释放；通过调节tau蛋白激酶和磷酸酯酶以减少tau蛋白高度磷酸化和聚集，从而减弱NLRP3炎性小体功能；脑组织内注射Aβ可NLRP3依赖方式诱导病理性tau蛋白纤维形成［9］。

4.β-淀粉样蛋白寡聚体通过血管周细胞收缩毛细血管研究 Aβ寡聚体可以通过血管周细胞收缩阿尔茨海默病人脑组织的毛细血管［10］。阿尔茨海默病早期脑血流量减少，因脑组织中的绝大多数血管阻力存在于毛细血管，表现为毛细血管壁可收缩周细胞功能障碍，因此有研究者验证是否存在Aβ通过周细胞收缩毛细血管的现象。英国伦敦大学学院（UCL）和Queen Square国家神经内外科医院对13例肿瘤手术切除的大脑皮质行免疫组化染色，结果显示，6例无Aβ沉积，3例Aβ适度沉积，4例Aβ大量沉积，随着Aβ沉积的加重，毛细血管管径逐渐变小。脑组织毛细血管周细胞上的Aβ压缩脑血管，这是由Aβ产生活性氧引起内皮素-1（ET-1）的释放、激活周细胞ETA受体所致［10］。该研究结论在啮齿动物模型中得到验证，阿尔茨海默病小鼠模型脑组织中亦发生毛细血管收缩而非小动脉收缩［10］。因此，抑制Aβ引起的毛细血管收缩可能减少阿尔茨海默病患者的能量缺乏、改善神经退行性变。

5.β-淀粉样蛋白依赖性神经元高度激活的恶性循环 德国慕尼黑工业大学研究所用阿尔茨海默病人脑组织来自美国麻省总医院麻省ADRC神经病理核心实验室，取材1例67岁男性阿尔茨海默病患者（Braak分期Ⅵ期）脑组织用于制备水溶性提取物，取材1例69岁女性阿尔茨海默病患者（Braak分期Ⅴ期）的大脑皮质用于分离淀粉样斑块，结合Aβ沉积小鼠模型发现，神经元高活化是由于抑制谷氨酸再摄取引起的，Aβ介导的神经元激活具有明显的神经元特异性；进一步对存在阿尔茨海默病病理改变的人脑组织进行Aβ二聚体提取和纯化，同样发现上述正反馈现象，并认为该现象是阿尔茨海默病神经炎性斑［NPs，亦称老年斑（SPs）］形成的早期机制，表明阿尔茨海默病早期环路功能障碍系Aβ依赖性神经元高度激活所致［11］。

6.睡眠-觉醒周期对脑间质液tau蛋白的调节研究 睡眠-觉醒周期可以调节阿尔茨海默病人脑组织间质液和脑脊液中的累积Aβ水平［12］，而慢性睡眠剥夺可促进Aβ斑块形成，其中，tau蛋白的累积可以驱动阿尔茨海默病的神经退化。美国华盛顿大学纳入8～16只小鼠（B6C3F1/J，P301S，B6C3-Tg，APP/PS-1）的脑组织以及6例认知功能正常者（30～60岁）的脑脊液，以探讨睡眠-觉醒周期和睡眠剥夺是否影响脑间质液和脑脊液中tau蛋白表达、形成和扩散。结果显示，小鼠脑间质液tau蛋白水平在正常觉醒期较睡眠期增加约90%、在睡眠剥夺期较睡眠期间增加100%，人脑脊液tau蛋白水平在睡眠剥夺期较睡眠期增加＞50%；进一步观察tau蛋白形成和扩散，发现慢性睡眠剥夺可促进小鼠脑间质液tau蛋白的病理性扩散，特别是小鼠的化学驱动觉醒可显著升高脑间质液中Aβ和tau蛋白水平，表明睡眠-觉醒周期可以调节脑间质液tau蛋白的表达，睡眠剥夺可以增加脑间质液和脑脊液中tau蛋白的表达和病理性扩散［12］。

7.空间转录组和原位测序研究 比利时VIB脑疾病研究中心从荷兰脑库获取3例阿尔茨海默病（平均年龄76岁）以及3例非痴呆对照（平均年龄为75岁）人脑组织额上回样本，均为女性。他们在前期的动物实验中采用空间转录组学观察到，阿尔茨海默病小鼠模型Aβ斑块周围直径100μm的结构域内发生转录变化，证实阿尔茨海默病早期改变与髓鞘和少突胶质细胞相关基因有关，而阿尔茨海默病后期改变则与补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症相关基因有关，并进一步采用原位测序方法在小鼠和人脑组织切片上得到确认［13］。由此可见，全基因组空间转录组学为阐明阿尔茨海默病及其他脑疾病提供了一种前所未有的方法。

8.体细胞APP基因重组研究 人脑多样性和复杂性被广泛认为是编码在1个恒定的基因组中，而体细胞基因重组通过改变种系DNA序列以增加分子多样性，理论上可以改变这种编码，但并未在人脑组织中证实。美国Sanford Burnham Prebys医学研究所研究用新鲜人脑组织由美国圣地亚哥大学阿尔茨海默病研究中心、加州大学欧文分校神经损伤和障碍研究所和马里兰大学脑组织库提供，包括7例散发性阿尔茨海默病和7例正常对照人脑组织，该项研究发现阿尔茨海默病相关编码β-淀粉样前体蛋白（APP）的基因在神经元中以数千种变体“基因组c DNAs”的嵌合体形式存在［14］。DNA原位杂交鉴定出单个神经元中基因组cDNAs与野生型位点不同，而非神经元中不存在基因组cDNAs，神经元“反向插入”RNA产生基因组cDNAs，这一过程包括转录、DNA断裂、逆转录酶活性和老化。散发性阿尔茨海默病人脑组织神经元可见增加的基因组cDNAs多样性，包括11种已知的与家族性阿尔茨海默病相关的突变，而正常对照人脑组织神经元则不存在这些突变，表明神经元基因重组可能允许“记录”神经活动，选择性“回放”绕过剪接表达的首选基因变体，这对细胞多样性、学习和记忆、可塑性以及脑疾病均有影响［14］。

9.大脑皮质环状RNA表达图谱显示出临床与病理的关联性 美国华盛顿大学医学院对来自其Knight阿尔茨海默病研究中心的83例阿尔茨海默病和13例正常对照人脑组织的顶叶皮质进行RNA测序，并参考西奈山脑库（MSBB）中阿尔茨海默病RNA测序数据，定量测定阿尔茨海默病背景下顶叶皮质环状RNA（circRNA）的表达变化，结果显示，circRNA含量与阿尔茨海默病诊断、临床痴呆严重程度和神经病理严重程度显著相关，而大多数阿尔茨海默病相关circRNA与mRNA表达无关，亦与各类型神经细胞比例无关［15］。该项研究还观察到，阿尔茨海默病相关circRNA与已知的阿尔茨海默病相关致病基因（APP、SNCA）共表达，并在阿尔茨海默病相关circRNA中识别出潜在的靶向致病微小RNA（mic RNA）结合位点。上述研究结果强调了分析非线性RNA的重要性，并可用于支持circRNA在阿尔茨海默病发病机制中潜在作用的研究［15］。

由此可见，通过总结2018-2020年阿尔茨海默病及相关疾病的重大研究成果，发现人脑组织在阿尔茨海默病及相关疾病的突破性研究中发挥重要作用。虽然人脑组织数量是脑库建设的衡量指标之一，但并不完全取决于人脑组织的储存数量，例如，Cell、Nature和Science等国际顶级期刊发表的相关研究中人脑组织数量均较少（表1），而是更主要取决于研究问题、研究技术和方法，以及各交叉学科技术的融合。

为适应神经科学和神经病学研究的快速发展，我国的脑库逐步建立并完善。2017年，以基础医学院为核心，我国成立中国人脑组织库协作联盟，制订《中国人脑组织库标准化操作方案》［16-17］；还成立中国解剖学会人脑库研究分会。同年，国家科技部批准依托中国医学科学院北京协和医学院和浙江大学医学院成立国家发育和功能人脑组织资源库、国家健康和疾病人脑组织资源库。2018年，以临床医学院为核心，国家神经系统疾病临床医学研究中心筹建中心脑库共同体［18］。河北医科大学脑库作为中国人脑组织库协作联盟单位和国家发育和功能人脑组织资源库共建单位，积极参与并撰写《人脑组织库生物安全防护共识》（待发表）。通过各单位的共同努力，在一定程度上改善我国科学家“无脑可用”的窘迫状况［19］。基于这些样本资源，国内研究者在中国人脑病理与生前认知功能相关性、衰老及阿尔茨海默病人脑组织Aβ斑块蛋白质谱等方面开展相关研究［20］。同时，针对我国脑科学研究的逐步推进，脑库作为其中的重要技术平台，参与到阿尔茨海默病等认知功能障碍疾病的队列研究中，共享样本和数据，结合临床诊断和尸检病理，揭示阿尔茨海默病发生发展的新机制、筛查作用明确且可干预的危险因素、获得早期精确诊断标志物和治疗靶点，从而在神经系统疾病诊断、治疗、预防中发挥越来越重要的作用。坚信我国脑库的发展将更加具有国际影响力和竞争力！

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