不同降酸剂处理对葡萄酒中赭曲霉毒素A含量的影响

刘 鸿，陈 静，李雅善，王艳君，张瑛莉，南立军,4*，刘丽媛

（1.楚雄师范学院资源环境与化学学院，云南楚雄 675000；2.北部湾大学食品工程学院，广西钦州 535000；3.新疆罄玉酒庄有限公司，新疆巴音郭楞蒙古自治州 841400；4.云南省高校葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，云南楚雄 675000；5.吐鲁番林果业技术推广服务中心，新疆吐鲁番 838000）

赭曲霉毒素有7 种结构相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A 是产毒量最多、分布最广、污染农产品最重的毒素[1-2]。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）属于弱有机酸[1]，化学性质稳定，耐热性好[3]。由于其肾毒性、肝毒性、抑制RNA和蛋白质合成等性质，对人和动物的健康构成了严重威胁[4]。赭曲霉毒素A 污染极易发生在植株种植和葡萄酒酿制期间[5]。当植株抗病力较弱或生长环境恶劣时更易受污染。在葡萄酒酿造过程中，相关的酿酒工具、陈酿容器等灭菌不到位，也易受到赭曲霉毒素A 污染。GB 2761 规定葡萄酒中的赭曲霉毒素A 含量上限为2 μg/kg[6]。

近年来赭曲霉毒素A 检测方法主要有高效液相色谱-串联质谱、超高效液相-串联三重四级杆质谱、化学发光生物传感器、离子交换固相萃取柱结合高仙液相色谱仪等。王兴龙等[7]认为高效液相色谱-串联质谱技术有高灵敏度、较好的选择性和分析效率，对高沸点、不易挥发和热不稳定化合物的分离鉴定有着独特优势，已成为赭曲霉毒素A 最常用的检测方法[8]。赵天宇等[9]和孙爱洁[10]采用高效液相色谱仪对葡萄酒中赭曲霉毒素A 进行检测，有明显的效果。由于人们对食品安全健康越来越重视，因此加强对葡萄酒安全风险检测关键技术的研究，可以提高风险评估能力，为葡萄酒安全检验和监督提供技术保障。

另一方面，由于葡萄品种的特性、栽培方式及环境等的影响，成熟度较差或不适宜酿酒的葡萄酿造的葡萄酒总酸会偏高，品尝时给人酸涩粗糙的感觉，应采取相应的工艺措施完善[11]。我们通常采用化学降酸剂有碳酸钙和酒石酸氢钾。不同的降酸剂降酸效果不同。碳酸钙降酸通常采用复盐法，反应速度快，成本较低，操作方便等[12]。酒石酸盐降酸是利用其与酒石酸互相作用生成溶解度较低的酒石酸氢盐，过滤除去，从而降低总酸含量[13]。降酸后葡萄酒的澄清度较好，酸涩感降低。但在葡萄酒降酸过程中，降酸的幅度过大，容易繁殖大量微生物，影响葡萄酒的质量和感官质量[14]。

本课题以夏黑葡萄为材料酿造干红葡萄酒，通过降酸剂碳酸钙和酒石酸氢钾降酸，然后比较降酸前后葡萄酒中赭曲霉毒素A 含量的变化情况，有助于评估真菌毒素污染带来的风险，提高葡萄酒的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料和酒样

原料：夏黑葡萄，产于楚雄市。酒样：样品一，未降酸原酒；样品二，经0.12 g/100mL 碳酸钙降酸处理。

1.1.2 试剂

碳酸钙、酒石酸氢钾、氢氧化钠，天津市大茂化学试剂厂；甲醇，天津市百世化工有限公司；三氯甲烷，成都市科隆化学品有限公司；石油醚、磷酸、酚酞、95%乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司；去离子水，睿希化工厂处。

氧氧化钠标准滴定溶液；酚酞指示液；5%磷酸（体积分数）；磷酸水溶液（pH=2.5）；赭曲霉毒素A 标准溶液（1.0 μg/mL）。

1.1.3 辅料

亚硫酸、果胶酶，天津市大茂化学试剂厂；安琪酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.1.4 仪器与设备

移液枪，德国埃彭多夫公司；恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；酸度计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；分液漏斗，潍坊铭阳实验分析仪器公司；附温比重瓶，上海信谊仪器厂有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；医用冷藏箱，中科美菱低温科技股份有限公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色谱仪，岛津（香港）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 干红葡萄酒发酵及其工艺流程

葡萄→分选→除梗破碎→添加二氧化硫、果胶酶及酵母→浸渍发酵→发酵监控（比重、温度）→发酵结束测定基本理化指标→酒的后期管理

1.2.2 干红葡萄酒降酸处理

（1）确定葡萄酒降酸剂梯度

通过对干红葡萄酒进行感官品尝，以及测定出的葡萄酒的总酸量，从而确定干红葡萄酒的降酸梯度。经计算碳酸钙用量为0.120 0 g，则设置碳酸钙的降酸梯度为0、0.100 0、0.110 0、0.120 0、0.130 0 g。经计算酒石酸氢钾用量为0.225 6 g，则设置酒石酸氢钾的梯度为0、0.205 6、0.215 6、0.225 6、0.235 6 g。

（2）降酸处理步骤

分别取30 mL 酒样于5 个三角瓶中，分别加入不同量的碳酸钙，溶解并混合均匀，静置24 h 后，再加入70 mL 酒样，待充分溶解后，冷冻，24 h 后除去沉淀，最后分别测定混合后干红葡酒中总酸含量、pH 值。以不添加碳酸钙的干红葡萄酒为空白对照组。

取100 mL 酒样，称取酒石酸氢钾加于5 组酒样中，溶解并混合均匀，静置24 h，去除沉淀，最后分别测定混合后干红葡酒中总酸含量、pH 值。以不添加酒石酸氢钾的干红葡萄酒为空白对照组。

1.2.3 葡萄酒理化指标检测

总酸[15]、酒精度[16]和pH 值[17]参照相应的方法。

1.2.4 感官品尝

由组成10 人的评估小组，依据表1 中的指标对上述经降酸处理后的酒样进行感官评价，满分为100 分，选择出最适宜的降酸剂及降酸剂添加量。

表1 感官品评表Table 1 Sensory evaluation sheet

1.3 高效液相色谱法测定赭曲霉毒素A

1.3.1 赭曲霉毒素A 标准品测定

将配制好的赭曲霉毒素A 标准储备溶液，分别配制成浓度为1、5、10、20 μg/L 和50 μg/L 的赭曲霉毒素A 标准溶液，采用HPLC 进行分析，横坐标为相应的赭曲霉毒素A 浓度，纵坐标为色谱峰面积，得到标准曲线，计算其回归方程和相关系数。

1.3.2 样品前处理

向分液漏斗中加入50 mL 干红葡萄酒样品，然后再加入50 mL 石油醚，按照规范操作对其进行震荡（10 min）以排气；静置待液体分层后对其进行分离，将上层石油醚从上口倒出并将其弃去；再取25 mL 石油醚对下层液体进行重复提取，静置分层后，收集下层液体；量取25 mL 去离子水以及25 mL 三氯甲烷加入到上步操作中收集的液体中进行重复萃取，对其进行震荡（10 min），静置分层并分离后，收集下层溶液；上层用25 mL 三氯甲烷提取震荡（10 min），三氯甲烷提取液进行合并，用电热套（40 ℃下）进行蒸发浓缩，待溶液快干时向其中加入2 mL甲醇，将其进行溶解超声后使用0.45 μm 滤膜进行过滤并吹干，再用500 μL 流动相（pH 为2.5 的磷酸水溶液与甲醇的比例为1∶1）溶解，进样10 μL[18]。

1.3.3 检测条件

色谱柱：C18 柱，柱长250 mm，内径20 mm，粒径5 μm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相A：水+5%磷酸（体积分数），调至pH=2.5，用0.45 μm 滤膜过滤，脱气；B：甲醇，A∶B=1∶1；进样量：10 μL；二元高压梯度洗脱程序；紫外检测器，检测波长：333 nm。

1.3.4 样品测定

将所用到的流动相过滤并超声脱气20～30 min 后装入液相滤头，打开液相色谱仪及电脑电源，开启输液泵（Infusion pump）以及检测器（Detector），进行排气泡操作。打开液相操作软件，创建仪器分析条件，开启输液泵，以所用流动相冲洗色谱柱，待基线平稳后进行进样。使用配套的液体进样针吸取处理好的样品10 μL，在Load 状态下打进进样阀后迅速旋至Inject 状态，系统开始测样记录。样品一为未降酸酒样，样品二为降酸后酒样。

对测定的样品的色谱峰图进行分析，整理数据并得出结论。

1.4 统计分析

采用Excel 2010 进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒理化指标检测数据

由表2 可知，随着碳酸钙和酒石酸氢钾添加量的增加，酒样的总酸逐渐降低，酒精度则不变。其中碳酸钙的添加量为0.100 0 g 时其总酸由原酒的8.7 g/L 降至6.1 g/L，pH 值则由2.8 升高至3.2；当碳酸钙的添加量为0.130 0 g 时 其总酸由原酒的8.7 g/L 降至5.0 g/L，pH 值则由2.8 升高至3.5，此组添加量对干红葡萄酒的降酸效果最为明显；酒石酸氢钾的添加量为0.205 6 g 时其总酸由原酒的8.7 g/L 降至6.3 g/L，pH 值则由2.8 升高至3.0，酒石酸氢钾的添加量为0.235 6 g 时，其总酸由原酒的8.7 g/L 降至5.1 g/L，pH 值则由2.8 升高至3.4，此组添加量对干红葡萄酒的降酸效果最为明显。

表2 未降酸葡萄酒的理化指标Table 2 Physical and chemical indexes of unreduced acid wine

2.2 降酸效果比较及感官分析结果

由表3 可知，化学降酸剂碳酸钙和酒石酸氢钾对干红葡萄酒都起到了降酸的作用，均可使葡萄酒总酸降低，pH 值升高。在使用碳酸钙进行降酸处理后，酒样底部产生白色沉淀，通过自然静置以及过滤的方法将酒样底部的白色沉淀除去；而使用酒石酸氢钾进行降酸后的酒样底部没有明显的沉淀。由纵向分析可得，随着碳酸钙和酒石酸氢钾添加量的增加，葡萄酒的颜色及香气基本不受影响，酒体酸感及余味受影响则较大，其中以碳酸钙添加量为0.13 g 的梯度对酒体感官影响最大，降酸过量使得酒体变得乏力，寡淡，余味短，以添加量0.12 g 为最佳，平均分为81.8 分是8 组中最高，该添加量有效的降低了葡萄酒的酸感，酒样澄清透明，呈深宝石红色，具有黑色水果的香气，且香气浓郁，酒体较柔顺，风格典型明确。酒石酸氢钾的降酸效果整体比碳酸钙的差，且降酸后酒体整体都不如经碳酸钙降酸后的酒体协调。总体来看，碳酸钙（复盐法）降酸效果比酒石酸氢钾的效果好。

表3 感官评分结果Table 3 Sensory evaluation results

通过两种降酸剂处理后，对表3 进行分析后发现，降酸剂对葡萄酒的颜色以及香气影响不显著，平均分都在18 分左右，与空白组（原酒样）的打分相差不大，对葡萄酒的余味以及风格两个因素影响较为显著。

2.3 赭曲霉毒素A 测定结果

梁桂娟等[19]研究发现，赭曲霉毒素A 标准品的峰值时间在11.8 min 前后，表明样品中的赭曲霉毒素A 应在高效液相色谱中进样11.8 min 前后出现高峰。

根据表4 中赭曲霉毒素A 标准曲线表绘制出赭曲霉毒素A 的标准曲线图，线性回归方程为Y=5074.4x+8801，相关系数R2=0.999 8，在1～50 μg/L 范围内线性关系良好，以三倍信噪比确定仪器检出限为0.069 μg/L，以十倍信噪比确定仪器定量限为0.235 μg/L。

表4 样品中赭曲霉毒素A 各项指标结果Table 4 Ochratoxin A index results in samples

通过分析降酸前后两个样品的色谱峰图后发现，梯度洗脱方法能够有效地将干扰峰与赭曲霉毒素A 的峰分开，排除杂质峰干扰[20]。两个样品中的赭曲霉毒素A 的保留时间均在11.5 min 前后，其中未经降酸处理的样品一中赭曲霉毒素A 的色谱峰图保留时间如图1 为11.449 min，经碳酸钙降酸（碳酸钙添加量为0.12 g）处理的样品二中赭曲霉毒素A 的色谱峰图保留时间如图2为11.551 min。酒样中赭曲霉毒素A 在降酸前的峰面积和高度分别为79 841 和28 718，在降酸后的峰面积和高度分别为79 879 和28 753，计算降酸前、后样品中的含量分别为0.033 9%和0.024 6%，表明降酸剂处理对葡萄酒中的赭曲霉毒素A 含量有一定的影响。

图1 样品一中赭曲霉毒素A 色谱峰图Fig.1 Chromatographic peak of ochratoxin A in sample 1

图2 样品二中赭曲霉毒素A 色谱峰图Fig.2 Chromatographic peak of ochratoxin A in sample 2

3 结论

本文研究了不同降酸剂对干红葡萄酒的降酸效果以及最适梯度，并对降酸剂处理前后葡萄酒中赭曲霉毒素A 的含量变化情况进行了研究，从改良葡萄酒感官质量的角度出发对葡萄酒中存在的赭曲霉毒素A 进行了分析。在经品尝小组品评打分后，以碳酸钙添加量为0.12 g为最佳，平均分为81.8 分，是8 组中最高，有效地降低了葡萄酒的酸感，酒样澄清透明，呈深宝石红色，具有黑色水果的香气，且香气浓郁，酒体较柔顺，风格典型明确。

建立了一种简单、高效的高效液相色谱检测方法，测定了降酸前后干红葡萄酒中的赭曲霉毒素A 的含量变化情况，样品中的赭曲霉毒素A 的保留时间均在11.5 min 前后，其中未经降酸处理的样品1 中赭曲霉毒素A的色谱峰的保留时间为11.449 min，经碳酸钙降酸（碳酸钙添加量为0.12 g）处理的样品2 中赭曲霉毒素A 的色谱峰的保留时间为11.551 min。酒样中赭曲霉毒素A 在降酸前的峰面积和高度分别为79 841 和28 718，降酸后的峰面积和高度分别为79 879 和28 753，计算降酸前、后样品中的含量分别为0.0339%和0.0246%，表明降酸剂处理对葡萄酒中的赭曲霉毒素A 的含量有一定的影响作用。

在本试验中，样品前处理方法采用液液萃取，操作较简便，但是在操作过程中会存在乳化现象，且有机试剂在操作过程中对人有一定的伤害[21]。本实验考虑到成本以及实验室条件等因素，最终确定样品前处理方式为液液萃取。由于实验室条件有限，部分有机试剂用类似功能的试剂代替；实验中所用的氯仿可用毒性较小且提取率高的的二氯甲烷代替。两个酒样中的赭曲霉毒素A 的色谱峰的保留时间与赭曲霉毒素A 标准品的色谱峰的保留时间有一定的差别，其原因有以下几点：一，由于样品前处理过程中存在操作方法的误差；二，由于流动相中的色谱纯乙腈使用色谱纯甲醇代替，从而导致洗脱效果没有理想中的好；三，由于仪器操作过程中存在操作方法的误差。