生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿光合效率及生长的影响

李鹏珍， 赵得琴,2， 邓 波*， 杨 军， 赵国华， 赵 亮

(1.中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100193； 2.宁夏回族自治区百辰产业投资有限公司， 宁夏 银川 750001；3.乌鲁木齐绿之园园林开发有限公司， 新疆 乌鲁木齐 830000； 4.特克斯县林业和草原局湿地保护站， 新疆 特克斯 835500)

水分不仅是限制地区农业生产的主要因子之一，也是畜牧业和经济可持续发展的重要保障，是不可替代的自然资源[1-3]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)被誉为“牧草之王”，是世界上广泛种植的豆科牧草，具有营养价值高、耐刈割、产量高和适应性强等特点。紫花苜蓿的生长受干旱胁迫影响较大，对干旱胁迫响应迅速，大多数地区种植紫花苜蓿需要灌溉维持[4]。近年来，关于苜蓿抗旱性研究主要集中于耐旱品种选育[5]、生物育种技术[6-7]、接种耐旱根瘤菌[8-9]等方面。目前，在抗旱品种选育方面一直存在耐旱、高产很难同时达到的现象，而转基因技术也存在转化效率低、遗传不稳定、研究进展不均衡等问题[10-11]。张淑卿等[12]研究发现，接种耐旱根瘤菌可提高植株抗旱能力，增加产量，为干旱地区植被的增产奠定理论基础。Sameh S A等[13]的研究也表明接种耐旱根瘤菌可以提高大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)耐旱性能。但是，根瘤菌基因突变快，土著菌竞争能力较强，仅依靠接种根瘤菌已不能解决因干旱带来的问题[14]。因此，改良生态环境、土壤结构和保持土壤肥力已成为现阶段学术界关注的热点。

生物炭具有含碳率高、孔隙结构丰富、理化性质稳定等特点，这些特点也是生物炭能够还田改土、提高农作物产量、实现碳封存的重要基础[15]。生物炭增产效应已在水稻(OryzasativaL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)、玉米(ZeamaysL.)等植物上得到验证[16-18]。光合作用是植物生长最重要的生理过程之一，研究植物的光合特性是研究植物适应其生存环境机制的有效途径[19]。干旱会使植物光合作用终止，新陈代谢紊乱，最终导致其死亡[20]。有研究表明，生物炭能够缓解干旱胁迫对植物光合作用的影响，能够提高花生(ArachishypogaeaLinn.)叶片光合速率和光系统II(PSII)的最大电子传递速率，增加花生荚果产量[21-22]。Abideen等[23]研究发现，经生物炭改良后土壤持水量增加，植物水分利用状况得到改善，导致净光合速率增加，提高了光系统II的能源利用效率，促进了植物生长。Alharby等[24]也发现，生物炭的添加可以减轻干旱胁迫对玉米水分利用效率方面产生的负面影响。Lehmann等[25]认为在土壤中施用生物炭是一种减少土壤氮素损失、提高氮肥利用率的有效方法。目前，关于生物炭添加对干旱胁迫下紫花苜蓿光合作用及生长影响的报道甚少。本试验在干旱胁迫条件下，通过在土壤中添加不同水平生物炭，研究接种根瘤菌后紫花苜蓿的净光合速率、叶绿素含量、生物量和叶面积等的变化，探究干旱胁迫下施加生物炭对接种根瘤菌紫花苜蓿光合特性和生长的影响，以期为紫花苜蓿抗旱栽培及其生理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为紫花苜蓿(‘中苜一号’)。供试土壤取自河北省涿州市中国农业大学试验示范基地，土壤类型为砂壤土，有机碳含量为0.059%，全氮含量为0.65%，全磷含量为0.93%，pH值为7.51，田间持水量为23%。根瘤菌为绿色荧光蛋白标记的中华苜蓿根瘤菌‘Sm1021’菌株(gfp-Sm1021)。玉米秸秆生物炭由辽宁市金和福生物炭科技有限公司提供，生物炭的基本理化性质如表1所示。

表1 生物炭的理化性质Table 1 Physicochemical properties of biochar 单位：g·kg-1

1.2 试验方法

挑取中华苜蓿根瘤菌‘Sm1021’菌株的单菌落，接种至TY液体培养基(硫酸链霉素400 mg·L-1、壮观霉素80 mg·L-1)，温度为28℃，180 rmp振荡培养48 h。然后选100粒籽粒饱满的紫花苜蓿种子，用75%的酒精浸泡3 min后用无菌水冲洗3次，再用消毒液浸泡2 min，用无菌水再次冲洗。最后置于人工气候培养箱中于26℃，光照16 h，黑暗8 h的条件下培养5 d后进行移栽。移栽时将幼苗放在苗床上的目标位置，挖去少量的浅层土壤，然后用移液枪移取100 uL的根瘤菌液接种在所移栽的幼苗根部，在保持根系完整的前提下将被挖去的浅层土壤填入根系周围，每个花盆移栽6株。

风干土和玉米秸秆生物炭过2 mm筛，经高温高压(121℃，103 KPa)灭菌2 h后，分装到花盆中，每个花盆中装入1 300 g土，玉米秸秆生物炭与土壤按2%，1.5%，1%，0.5%，0%的配比混匀，每种配比24盆，在生长期间按常规进行统一管理，定期定量供水，浇水量为最大田间持水量的75%～80%(土壤基质田间持水量为23%，土壤最大田间持水量为100%时的净含水量为23%)。

在各生物炭水平上进行干旱处理，每个处理6盆。从移栽之日起，每两天称重并浇一次蒸馏水。试验共设4个水分梯度，正常水分处理为最大田间持水量的75%～80%(W0)，轻度干旱胁迫为最大田间持水量的55%～60%(W1)，中度干旱胁迫为最大田间持水量的35%～40%(W2)，重度干旱胁迫为最大田间持水量的15%～20%(W3)，自干旱胁迫之日起，每天称重并浇灌一次蒸馏水，严格保持干旱梯度，干旱处理28 d后，进行相关指标的测定。

1.3 测定指标

1.3.1光合特性的测定 叶面积：采用方格纸法测定叶面积，每1个处理中选取4个植株，取出从植株顶端依次向下数的第3个叶片。将选好的叶片放在单位面积为1 mm×1 mm的方格纸上，用相机进行拍照，保证叶片的完整度，根据叶片所占方格面积计算出苜蓿的叶面积[26]。

叶绿素含量：采用丙酮乙醇混合法测定[27]。称取0.1 g新鲜苜蓿叶片，用去离子水清洗干净，用剪刀将叶片剪成1～2 mm宽的细条，放入50 ml进口离心管中，加入10 ml 80%的丙酮溶液和5 ml 95%的乙醇溶液，拧紧盖子，在室温下黑暗处静置8～12 h，待叶片变白后，取上清液分别在663 nm和645 nm波长下测定吸光度值，并按以下公式计算叶绿素含量：

叶绿素含量(mg·g-1)=(8.05A663+20.29A645)×V/1 000 W

公式中：A663，A645分别指叶绿素提取液在663 nm和645 nm处的吸光度值

V—提取液体积(mL)

W—叶片重(g)

光合效率：使用便携式光合仪(Li-6400，美国)测定紫花苜蓿叶片净光合速率(Photosynthetic rate,Pn)、细胞间隙CO2浓度(CIntercellular CO2concentration,Ci)、气孔导度(Stomatal conductance,Gs)、蒸腾速率(Transpiration rate,Tr)。每个处理选择3株植物，每株植物选取1片位于分蘖上两层且完全展开的健康叶片，测量时取叶片中间部位置于叶室，并做好标记，每个叶片重复测3次。使用Li-6400 File Exchange 2.04分析软件得到各处理的光合参数[28]。

1.3.2生物量的测定 处理28 d后，从每种处理中随机选出3个植株，将植株地上、地下部分离，分别装在纸袋中，将分装好的样品放在105℃的烘箱中杀青10 min，然后将烘箱温度降至65℃烘干，冷却后称重[29]。

1.4 数据分析

采用单因素方差分析(One-way Anova)进行处理间差异比较，采用Duncan法进行多重比较。采用Person相关分析紫花苜蓿生物量与各光合指标之间的相关性，所用软件为SPSS 17.0。

2 结果与分析

2.1 不同水平生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿光合特性的影响

2.1.1紫花苜蓿叶面积的变化 叶面积是一个与产量和干物质生产生理过程有关的重要组成成分，同时又是比较容易控制的一个因素，更是测定植株光合能力的最好指标。如图1所示，干旱胁迫和生物炭施用对紫花苜蓿叶面积有显著影响(P<0.05)，二者之间交互作用未达到显著水平；生物炭水平相同时，苜蓿叶面积随干旱程度的增加显著降低(P<0.05)，与W0相比，W3干旱胁迫后植株叶面积降低最显著(P<0.05)，下降幅度分别为76.11%，72.82%，81.60%，82.35%和78.33%。W0与W2处理下，与不添加生物炭的植株相比，1%或1.5%水平的生物炭能够显著增加植株叶面积(P<0.05)；W1与W3干旱胁迫时，添加水平为2%的生物炭后植株叶面积较不添加生物炭植株分别增加了21.64%和16.11%。由此说明，干旱胁迫下添加生物炭有利于叶片生长发育，水平为1%的生物炭促进效果最显著，其次为1.5%的生物炭。

图1 生物炭对干旱胁迫下接种紫花苜蓿叶面积的影响Fig.1 Effect of biochar on leaf area of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress注：小写字母表示各指标在相同水分处理下不同生物炭水平之间差异显著(P<0.05)，大写字母表示同一生物炭水平下不同水分处理各指标之间差异显著(P<0.05)。W0代表正常供水;W1代表轻度干旱胁迫;W2代表中度干旱胁迫;W3代表重度干旱胁迫。*显著相关(P< 0.05)，下同Note:Lowercase letters indicate significant differences in 5% levels between different biochar levels under the same water treatment,capital letters indicate significant differences in 5% levels between different water treatment indexes under the same biochar level. W0 for normal water supply;W1 for mild drought stress;W2 for moderate drought stress,W3 for severe drought stress;* means significant correlation at the 0.05 level,the same as below

2.1.2紫花苜蓿叶绿素含量的变化 叶绿素含量是反映植物叶片光合能力及植株健康状态的重要指标。由图2可知，生物炭添加和干旱胁迫对紫花苜蓿叶绿素含量有显著影响，二者之间交互作用显著(P<0.05)；W0，W1和W3时添加生物炭对植株叶绿素含量的影响未达到显著水平，而W2干旱胁迫时添加生物炭后植株叶绿素含量显著提升(P<0.05)；不添加生物炭时，W2干旱胁迫处理后植株叶绿素含量显著低于W0与W1(P<0.05)；生物炭水平为0.5%时，W1与W2干旱胁迫后叶绿素含量上升了10.11%和11.23%；生物炭水平为2%时，W0，W1和W2处理后叶绿素含量显著高于W3(P<0.05)。

图2 生物炭对干旱胁迫下接种紫花苜蓿叶绿素浓度的影响Fig.2 Effect of biochar on Chlorophyll concentration of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress

2.1.3紫花苜蓿光合效率的变化 光合作用是植物生长和物质积累的基础，对植物生长发育具有重要意义。如图3A所示，W1，W2和W3干旱胁迫时添加生物炭和干旱胁迫对Pn有显著影响，二者交互作用显著(P<0.05)，W1，W2，W3干旱胁迫时Pn随生物炭浓度的升高先增加后降低；生物炭水平相同时，与W0相比，W3干旱胁迫时Pn有所下降，下降幅度分别为53.87%，38.22%，26.84%，41.13%和58.70%。在干旱胁迫下施用不同水平生物炭对紫花苜蓿光合效率起到了一定的缓解作用，且随添加水平的升高，缓解作用呈先增加后降低的变化。W1干旱胁迫时，与不添加生物炭相比，施加0.5%和1%的生物炭后Pn显著升高(P<0.05)，分别提高了15.71%和22.54%。W2干旱胁迫时，添加1%水平的生物炭后Pn提高了25.98%。W3干旱胁迫时，添加0.5%，1%和1.5%水平的生物炭后Pn显著高于不添加生物炭的植株(P<0.05)。

由图3B可知，生物炭和干旱胁迫显著影响植株Gs，二者之间存在互作效应(P<0.05)。W1，W2和W3干旱胁迫时添加生物炭后Gs随生物炭浓度的增加先上升后降低。W2和W3干旱胁迫时Gs相较W0均有不同程度降低。W1干旱胁迫时施加0.5%，1%或1.5%的生物炭对Gs的缓解作用达到了显著水平(P<0.05)。W2与W3干旱胁迫时添加1%水平的生物炭后Gs有所上升，分别较不添加生物炭的植株增加了36.62%和35.52%。

如图3C所示，W1和W2处理时，干旱胁迫和生物炭添加对植株Ci互作效应显著(P<0.05)，随生物炭浓度的上升Ci先增加后降低。各生物炭水平下，W3干旱胁迫时Ci降低最明显，分别降低了31.72%，25.99%，17.8%，12.20%和23.85%。W1和W2干旱胁迫时添加1%水平的生物炭后Ci显著高于生物炭添加量为2%的植株(P<0.05)。

如图3D所示，W0处理时添加生物炭对植株蒸腾速率的影响未达到显著水平，W1，W2和W3处理时干旱胁迫和生物炭对蒸腾作用有显著互作效应(P<0.05)。与干旱处理时添加不同水平生物炭对植株Pn，Ci和Gs三个指标的影响相同，生物炭添加对Tr起到了一定的促进作用，但是W3干旱胁迫后植株Tr依旧显著低于其他水分处理(P<0.05)。W1，W2和W3干旱胁迫时添加1%的生物炭后Tr显著高于未添加生物炭的植株(P<0.05)。

2.2 不同水平生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿生物量的影响

由表2可知，生物炭和干旱胁迫显著影响植株地上干重，二者之间互作效应显著(P<0.05)。随着干旱程度的增加，紫花苜蓿地上干重显著降低(P<0.05)。W0处理时，地上干重随生物炭水平的升高而增加，生物炭水平为2%时植株地上生物量是不添加生物炭植株的1.6倍；W1与W2干旱胁迫时，紫花苜蓿地上干重随生物炭水平的增加呈先升高后降低的趋势，W1干旱胁迫时最适生物炭水平为0.5%或1%，地上干重分别提升了24.80%和15.86%。W2干旱胁迫时添加2%的生物炭后地上干重较不添加生物炭的植株相比降低了34.52%。W3干旱胁迫时，添加不同水平生物炭对紫花苜蓿地上干重影响不大。由此可见，干旱胁迫下，高水平生物炭对植株地上生物量产生了抑制作用。

生物炭和水分处理显著影响植株地下干重，二者之间互作效应显著(P<0.05)。不添加生物炭时，与W0相比，W1与W2干旱胁迫能够提升植株地下干重，提升幅度分别为37.65%和53.26%。除W1干旱胁迫时添加0.5%水平的生物炭后紫花苜蓿地下干重显著升高外(P<0.05)，其他干旱胁迫对地下干重影响不显著。添加2%的生物炭后，各干旱胁迫下植株地下干重均降低。

图3 生物炭对干旱胁迫下接种紫花苜蓿光合效率的影响Fig.3 Effect of biochar on photosynthetic of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress

2.3 接种紫花苜蓿光合特性与生物量之间的相关性

由表3可知,各指标进行相关性分析的结果显示，植株叶面积与光合效率呈极显著正相关关系(P<0.01)。植株Pn，Ci，Gs，Tr与产量极显著相关(P<0.01)，是引起植株地上生物量变化的主要因素，但光合效率与地下生物量无显著相关关系。

表2 生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿生物量的影响Table 2 Effects of biochar and drought stress on biomass of inoculated alfalfa

表3 紫花苜蓿光合特性与生物量之间的相关性Table 3 Correlation between photosynthetic characteristics and biomass of alfalfa

3 讨论与结论

植物的叶片不仅是对生长环境变化敏感、变异性和可塑性较大的组织器官，同时也是光合和呼吸等生理代谢活动的功能器官[30]。本研究结果表明，紫花苜蓿叶面积和光合特性均受到了水分胁迫的影响，添加生物炭对干旱胁迫起到了一定的缓解作用，这与Zoghi[31]的研究结果一致。生物炭添加不仅能使植株叶面积增大用以捕获光能，还能提高净光合速率，促进植物光能利用效率[32]。同一干旱胁迫下，随着生物炭水平的升高，紫花苜蓿叶面积先增加后降低，表明适量生物炭(1%或1.5%)对其有良好的促进作用。Pn，Gs，Ci和Tr是表征植物叶片光合作用的重要指标，其大小可直接反映该植物的光合能力，进而决定植物生长发育和生产力[33]。本研究发现，干旱胁迫下添加生物炭后紫花苜蓿叶片光合效率指标均出现“低促高抑”的现象，轻度与中度干旱胁迫添加0.5%或1%的生物炭后Pn显著高于其他添加水平的植株，表明干旱条件下适量生物炭添加对植株光合作用起到了促进效果。重度干旱胁迫时添加2%水平的生物炭后紫花苜蓿叶绿素含量降低，重度干旱阻碍植株的水分供应，减缓植株生理代谢过程，抑制叶绿素合成[34]。光合参数在不同施炭量下变化不一样，可能是施炭量不同会影响土壤养分组成和理化性质，进而影响苜蓿根系对养分的吸收和地上部的光合作用[35]。

生物量能够直接反映植物的生长状况，生物量与地上部分光合能力密切相关。前人研究发现，严重水分胁迫会抑制植物PSⅡ光化学活性，从而影响紫花苜蓿干草产量[36]。土壤含水量对植物光合作用影响很大，水分亏缺时，气孔阻力增加，CO2进入受阻，光合效率降低[37-38]。生物炭对缓解植物逆境胁迫方面有重要作用，施用生物炭能提高植物叶片的光合参数，增强叶片光合积累能力[39]。本研究发现，添加生物炭不仅有助于提高叶片光合效率，也能增加植株叶绿素含量，促进干物质积累，为后期产量形成奠定基础。这是因为适量生物炭施用可有效提高紫花苜蓿叶片光能利用率，调控植物对养分的吸收与运转，保障地上部光合产物的形成、积累与转化。一般认为，生物炭对植物生长和产品质量的影响也与生物炭施用量等诸多因素有关。Asai等[40]研究发现，水稻产量随生物炭用量的增加而增加，但当生物炭施用量达16 t·hm-2时，其产量不再增加。本试验结果与其不同，本试验中无水分胁迫时添加2%水平的生物炭后地上生物量较不添加生物炭的植株增加1.6倍，这可能是因为正常水分处理下生物炭添加给根瘤菌提供了良好的生存环境，促进苜蓿对土壤氮素的吸收与利用，提高苜蓿干物质的积累[41]。本研究发现，干旱胁迫时添加2%的生物炭后紫花苜蓿地上与地下生物量较不添加生物炭的植株相比均降低，这与李明阳等[42]的研究结果一致，可能是因为高浓度生物炭会提高土壤碳氮比，降低土壤中有效氮含量，不利于植物吸收养分。本试验表明，适量生物炭添加能改善干旱胁迫下接种紫花苜蓿的生长和光合特性，这与李东庭等[43]对基质添加生物炭对辣椒育苗效果的影响结果一致。植株叶绿素含量，Pn，Ci，Gs和Tr均随生物炭添加量的增加而提高，且在轻度与中度干旱胁迫时添加0.5%或1%的条件下效果最佳。这一方面是因为生物炭保水、保肥特性能够提高苜蓿对水分和养分的吸收，进而提高光合效率、促进生长。另一方面可能是因为生物炭添加给根瘤菌提供了良好的生存环境，减缓植物受到干旱胁迫的程度，间接提高紫花苜蓿的光合作用速率和干物质积累速率[44]。

综上所述，在基于接种根瘤菌条件下适量生物炭添加可明显缓解干旱胁迫对紫花苜蓿叶片光合作用的抑制，促进紫花苜蓿生长。过量施用生物炭会降低植物光合效率，抑制植物正常生长。总体而言，干旱处理后中等生物炭用量(0.5%～1%)能够提高紫花苜蓿生物量，但本研究只是短期研究，生物炭添加对干旱胁迫下植被生长的作用机制尚且未知，还需通过田间试验深入探究。