应用响应面法优化桑椹果叶酒发酵工艺

雷 静，陈 雅，廉苇佳，韩 琛，阿依加马丽·加帕尔，任红松

(新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所,新疆吐鲁番 838000)

0 引 言

【研究意义】桑椹含有丰富的花青素、维生素、白藜芦醇、矿物质及微量元素等成分[1]。桑叶富含r-氨基丁酸、黄酮苷、生物碱、多糖等生物活性成分[2]，将两者按照比例混合发酵得到桑椹果叶酒，产品不仅含有桑椹果实赋予的果香及生物活性物质，还含有桑叶给予的功能性物质，使酒的成分更加丰富，功效更加显著[3,4]。桑椹浆果的收获季节性强,且在运输和储藏过程中也极易受到外界环境的影响而腐败变质，桑椹通常被加工成果汁、果醋和果酒等产品。吐鲁番地区是桑树适宜生长的地区，据不完全统计，现有桑树约2 466.6 hm2(3.7万亩)，产量约2×104t，但对桑椹资源的加工利用程度尚不高，每年又有大量桑椹，桑椹加工果酒不仅充分利用桑资源，而且丰富了果酒市场，增加桑椹的附加值[5]。【前人研究进展】李莉[6]利用鲜桑叶、枸杞、白酒调配出桑叶保健酒；马慧等[7]利用桑椹和桑椹叶制作的桑椹叶果复合饮料；黄进等[8]以桑椹为主要发酵原料，制备了发酵型桑椹果酒，研究杂醇油与生物胺的变化规律，对其工艺进行了优化；欧燕等[9]利用桑椹和草莓2种原料生产出了桑椹-草莓复合果酒；杨芳等[10,11]以桑椹为原料，制作桑椹果酒，测定其主要成分动态变化规律及香气成分分析；吴继军等[12,13]检测了桑椹汁发酵过程中其糖类、有机酸、维生素等成分的变化；Wang等[14]研究了桑椹果酒在发酵过程中酚类化合物的动态变化。【本研究切入点】国内外有关桑椹果酒发酵工艺研究的报道较多，而以桑椹和桑叶作为原料混合发酵果酒的工艺研究尚未见报道，有研究采用响应面法，优化桑椹果叶酒发酵工艺参数[15]。研究响应面法优化桑椹果叶酒发酵工艺。【拟解决的关键问题】以黑桑椹和干桑叶为原料，采用单因素实验及方差分析方法，分析影响桑椹果叶酒品质显著的因素，利用响应面法分析各因素对桑椹果叶酒进行感官评分。优化桑椹果叶酒发酵工艺，确定工艺参数，为桑椹酒加工企业提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 黑桑椹

采摘于吐鲁番高昌区园艺场；桑叶，采摘于吐鲁番高昌区园艺场；白砂糖，新疆中唐糖业有限责任公司。

1.1.2 试剂

盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾、乙醇，均为分析纯；NaHCO3、柠檬酸，均为食品级；果胶酶，上海康禧食品饮业有限公司；焦亚硫酸钾，ESSECO S.R.L.；酿酒高活干酵母(LALVIN EC-1118)，上海杰兔工贸有限公司。

1.1.3 仪器

TP-A500型电子分析天平，美国康州HZ电子有限公司；UV754N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；控温发酵罐FJG-1、储酒罐，吐鲁番市耀扬金属制品有限公司；制冷设备ICA-20L，上海康赛制冷设备有限公司；打浆机DJ-330，温州市龙湾东霸食品机械厂；酒精计；全自动电位滴定仪。

1.2 方 法

1.2.1 样品制备

黑桑椹：采摘于吐鲁番高昌区园艺场，采摘后2 h之内榨汁，加入二氧化硫静止2 h，再加入果胶酶低温静止备用。

桑叶：桑叶采摘后洗净，晾干，粉碎备用。

1.2.2 工艺流程

桑叶

↓

新鲜黑桑椹→分选→榨汁→加焦亚硫酸钾→酶解处理→调节糖酸→接种酵母→控温发酵→终止发酵→低温澄清→倒灌→陈酿→澄清过滤→杀菌→灌装→成品

1.2.3 单因素实验1.2.3.1 不同采收期的桑叶对桑椹果叶酒品质影响

以桑椹汁与桑叶质量比为100∶1，初始糖度为22%、初始pH值为3.5、酵母接种量0.03%、发酵温度18℃进行桑椹果叶酒发酵，研究不同采收期桑叶(春季桑叶、夏季桑叶、秋季桑叶、霜后桑叶)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.3.2 不同原料配比对桑椹果叶酒品质影响

主要以桑椹汁、霜后桑叶为原料，初始糖度为22%、初始pH值为3.5、酵母接种量0.03%、发酵温度18℃进行桑椹果叶酒发酵，研究不同配比原料(桑椹、桑叶质量配比分别为20∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.3.3 不同初始糖度对桑椹果叶酒品质影响

以桑椹汁与桑叶质量比为100∶1、初始pH值为3.5、酵母接种量0.03%、发酵温度18℃进行桑椹果叶酒发酵，研究不同初始糖度(18%、20%、22%、24%和26%)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.3.4 不同初始pH值对桑椹果叶酒品质影响

以桑椹汁与桑叶质量比为100∶1、初始糖度22%、酵母接种量0.03%、发酵温度18℃进行桑椹果叶酒发酵，研究不同初始pH值(2.5、3.0、3.5、4.0和4.5)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.3.5 不同发酵温度对桑椹果叶酒品质影响

以桑椹汁与桑叶质量比为100∶1、初始糖度22%、初始pH值为3.5、酵母接种量0.03%进行桑椹果叶酒发酵，研究不同发酵温度(14、18、22、26和30℃)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.3.6 不同酵母接种量对桑椹果叶酒品质的影响

以桑椹汁与桑叶质量比为100∶1、初始糖度22%、初始pH值为3.5、发酵温度18℃进行桑椹果叶酒发酵，研究不同酵母接种量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%)对桑椹果叶酒品质的影响。

1.2.4 Box-Behnken中心组合

在单因素实验基础上，筛选4个影响较大的因素，设置3个对桑椹果叶酒感官评分值影响较大的水平，建立4因素3水平的Box-Behnken中心组合实验[16]，以桑椹果叶酒感官评分为响应值，各因素的3个水平采用-1、0、1进行编码。表1

表1 响应曲面设计实验因素水平和编码Table 1 Response surface factor levels

1.2.5 指标测定1.2.5.1 酒精度、总糖、总酸

按照GB15038-2006的规定执行[17]。

1.2.5.2 桑椹果叶酒感官评分评定标准

以色泽、澄清度、香气、滋味、典型性5个方面为指标，对桑椹果叶发酵酒的感官品质进行综合评价，满分为100分。由10名品评人员组成品评小组，进行感官评定，去掉1个最高分和1个最低分后，取其平均分作为感官评分(取小数点后1位)[18]。表2

表2 桑椹果叶酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of apricot wine

1.3 数据处理

数据采用Excel2007 统计分析，重复3次，结果用“平均值±标准差”表示，采用SPSS软件对数据进行处理与回归分析。通过Design-Expert 8.0.6 统计分析软件进行响应面实验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 桑叶对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同采收期桑叶对桑椹果叶酒品质指标具有显著性差异，霜后桑叶发酵产品酒精度最高为12.2%vol，夏季桑叶发酵产品的酒精度最低为11.5%vol，夏季桑叶发酵的产品感官评分最低为82.3分，霜后桑叶发酵的产品感官评分最高为90.3分。表3

表3 不同采收期桑叶下桑椹果叶酒的品质变化Table 3 Effect of mulberry leaves at different harvest time on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.2 原料配比对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同原料配比发酵的产品品质指标具有显著性差异，原料配比200∶1发酵产品的酒精度较高为12.2%vol，原料配比20∶1发酵产品的酒精度较低为10.8%vol，原料配比20∶1发酵产品的感官评分最低为79.3分，原料配比100∶1发酵产品的感官评分最高为90.8分，原料配比20∶1发酵的桑椹果叶酒桑叶味较浓，不能体现桑椹的果香味。100∶1为较适宜的桑椹果叶酒原料配比。表4

表4 不同原料配比下桑椹果叶酒的品质变化Table 4 Effect of different raw material ratio on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.3 初始糖度对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同初始糖度桑椹汁发酵的桑椹果叶酒品质指标具有显著性差异，初始糖度为18%的产品残糖最低为6.8 g/L，酒精发酵比较彻底，糖分大部分转化为酒精，初始糖度为26%的产品残糖最低为20.6 g/L，初始糖度为18%发酵产品的感官评分最低为83.8分，初始糖度为22%发酵产品的感官评分最高为90.7分， 22%为发酵桑椹果叶酒较适宜的初始糖度。表5

表5 不同初始糖度下桑椹果叶酒的品质变化Table 5 Effect of different initial sugar content on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.4 初始pH值对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同初始pH值桑椹汁发酵的桑椹果叶酒品质指标具有显著性差异， pH值为3.5的产品残糖最低为12.1 g/L，酒精发酵情况较好，糖分几乎转化为酒精，pH值为2.5的桑椹果叶酒残糖最高为65.6 g/L，初始pH值2.5桑椹汁发酵产品的感官评分最低为78.5分，初始pH值3.5桑椹汁发酵产品的感官评分最高为90.5分， pH值3.5为发酵桑椹果叶酒较适宜的初始pH值。表6

表6 不同初始pH值下桑椹果叶酒的品质变化Table 6 Effect of initial pH value on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.5 发酵温度对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同温度发酵的桑椹果叶酒品质指标具有显著性差异，发酵温度为14℃，发酵时间最长为13 d，发酵温度为30℃，发酵时间最短为5 d，发酵温度30℃发酵的桑椹果叶酒酸度最高，发酵温度30℃发酵产品的感官评分最低为79.6分，发酵温度18℃发酵产品的感官评分最高为90.8分，18℃为发酵桑椹果叶酒较适宜的发酵温度。表7

表7 不同发酵温度下桑椹果叶酒的品质变化Table 7 Effect of fermentation temperature on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.6 酵母接种量对桑椹果叶酒的品质影响

研究表明，不同酵母接种量发酵的桑椹果叶酒品质指标具有显著性差异，酵母接种量为0.01%，发酵时间最长为11 d，酵母接种量为0.05%，发酵时间最短为7 d，酵母接种量为0.01%发酵的产品残糖最高为30.5 g/L，酵母接种量为0.03%发酵的产品残糖最低为11.3 g/L，酵母接种量为0.01%发酵产品的感官评分最低为78.6分，酵母接种量为0.03%发酵产品的感官评分最高为91.0分， 0.03%为发酵桑椹果叶酒较适宜的酵母接种量。表8

表8 不同酵母接种量下桑椹果叶酒的品质变化Table 8 Effect of inoculum on the quality of mulberry fermented wine

2.2 响应面数据

2.2.1 响应面

各因素对桑椹果叶酒感官评分指标的影响大小依次为发酵温度﹥初始pH值﹥原料配比﹥初始糖度﹥酵母接种量，以桑椹果叶酒感官评分为响应值(Y)，以原料配比(A)、初始糖度(B)、初始pH值(C)和发酵温度(D)为自变量，建立4因素3水平中心组合实验，共包括29个实验方案，其中24个析因实验点，5个中心实验点，用以计算实验误差。表9

表9 响应面实验方案及结果Table 9 Response surface methodology and results

2.2.2 回归方程拟合及方差

对各因素回归拟合后，得到回归方程：

Y=91.36+0.37A-0.198B+1.02C-1.56D+0.45AB-0.43AC-0.67AD+0.33BC-0.25BD+0.90CB-2.96A2-1.85B2-2.53C2-3.02D2

F模型=67.60，P模<0.000 1，拟合获得的模型方程极显著，回归模型与实测值拟合程度好，可用该回归方程替代实验真实点对结果进行分析。F失拟=3.57，P失拟=0.115 9>0.05，失拟项不显著。模型中A、C、D的P值<0.01表现为差异极显著，初始pH值、发酵温度、原料配比对桑椹果叶酒感官评分的影响极其显著，各因素影响感官评分顺序为发酵温度﹥初始pH值﹥原料配比﹥初始糖度。 A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，A2、B2、C2、D2对桑椹果叶酒感官评分的影响极其显著。交互项AD、CD的P值都小于0.01，AD、CD对桑椹果叶酒感官评分的影响极其显著。交互项AB、AC、BC、BD的P值均大于0.05，对桑椹果叶酒感官评分影响不显著。模型的决定系数R2=0.985 4，校正决定系数是0.970 8。

表10 回归模型及方差Table 10 Regression model and analysis of variance

2.2.3 响应面图

研究表明，随着原料配、初始糖度、初始pH值、发酵温度由水平-1向+1变化时，桑椹果叶酒感官评分出现先增大后减小的趋势。原料配比、初始糖度、初始pH值和发酵温度之间的交互作用对感官评分的影响程度。图1

图1 各因素交互作用响应曲面Fig.1 The interaction of various factors in response to the surface diagram

2.2.4 验证实验

最适桑椹果叶酒发酵工艺条件为原料配比103.64、发酵温度17.04℃、 初始pH值3.59、 初始糖度21.83%。将工艺条件调整为原料配比103.5∶1、发酵温度17.0℃、 初始pH值3.6、 初始糖度21.8%。桑椹果叶酒感官评分的平均值为91.5分。

3 讨 论

选择霜后桑叶发酵桑椹果叶酒较适宜[19]。随着初始糖度的增加，酒精度逐渐升高。这主要是因为酒精发酵主要依靠糖来转化为酒精，糖度含量越高，酒精度越高[20]，对时间的影响主要是因为桑椹汁的pH值太低影响酵母活性，抑制发酵过程，使发酵周期明显延长[21]；响应面越陡峭，两因素间的交互作用越明显[18]，原料配比和发酵温度的交互作用与初始pH值和发酵温度的交互作用对桑椹果叶酒感官评分的影响显著，其余因素间交互作用影响不显著，这与方差分析结果一致[22,23]。

原料是保证果酒产品质量的重要因素之一，它将直接影响果酒酿造后的品质[24]。研究采用桑椹果实和桑叶为主要原料混合发酵制得桑椹果叶酒，桑叶中含有酚类、生物碱、氨基酸、多糖、微量元素等营养和生物活性成分，其中桑叶中的r-氨基丁酸(GABA)含量较高，一种强神经抑制性氨基酸，桑叶还含有1-脱氧野尻霉素(DNJ)天然生物碱成分，它是一种a-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖的功效，因桑叶丰富的营养价值，有关于桑叶茶、桑叶饮料等功能性食品的研究，桑椹桑叶混合发酵研究方面，王艺霖[4]研究了不同比例的桑叶添加量对桑椹桑叶发酵酒中酚类，生物碱，氨基酸等成分含量的影响，最终选定2%的桑叶粉添加量为混合发酵酒的较合适添加量。

桑椹果叶酒在发酵过程受到原料配比、酵母菌种、发酵温度、初始糖度、初始pH值、初始SO2浓度、酵母接种量、发酵时间等多种因素的影响[25]，这些因素直接或间接的影响酒的色泽、香气、口感等感官品质。该研究在前期研究中，对不同时节的干桑叶、原料配比、初始糖度、初始pH值、酵母接种量、发酵温度进行单因素试验，后筛选出原料配比、初始糖度、初始pH值、发酵温度对桑椹果叶酒感官评分的影响较大的4个因素进行响应面实验设计。叶学林[26]等采用桑椹为主要原料，以感官评分为指标，采用响应面法优化桑椹果酒发酵工艺，得到起始糖度22.6%，起始pH 3.6，主发酵温度15℃，这与试验中选择的这3个指标的研究结果基本一致，这主要是因为桑椹果叶酒的主要原料为桑椹，桑叶的比例占得较小，低温发酵能够较好的保持桑椹酒的果香及色泽，整个发酵过程两者差别不大。而与范玉婷[3]、任博[18]等以桑椹为原料优化桑椹酒工艺，得出最优发酵温度为25℃，这与试验中发酵温度指标的研究结果不一致，这主要是因为不同的原料，不同的发酵环境，及研究者的评判标准不一致。

4 结 论

通过以桑椹果叶酒感官评分为响应值(Y)，原料配比(A)、初始糖度(B)、初始pH值(C)和发酵温度(D)为自变量建立回归方程：Y=91.36+0.37A-0.198B+1.02C-1.56D+0.45AB-0.43。

AC-0.67AD+0.33BC-0.25BD+0.90CB-2.96A2-1.85B2-2.53C2-3.02D2，得到最适桑椹果叶酒发酵工艺条件为原料配比103.64、发酵温度17.04℃、 初始pH值3.59、 初始糖度21.83%，在此条件下的桑椹果叶酒感官评分最大理论值为91.63分。实际测得桑椹果叶酒感官评分的平均值为91.5分，实验值与模型回归值一致性良好，实验误差小，可以用此模型分析、预测各因素对桑椹果叶酒感官评分值的影响。该回归模型具有较好的预测性能。