基于网络药理学探讨沉香治疗腹痛的作用机制

笪玉荣

(江汉大学 医学院， 湖北 武汉 430000)

腹痛是临床最常见的症状之一，其病因复杂，可由腹腔多种器官或者组织的病理性改变所致。临床诊治中对其病因判断的难度较大，常需结合患者的腹痛部位、腹痛性质、伴随症状等进行综合判断。此外，临床急症中急性炎症性腹痛起病急、进展快、病情多变，若治疗不及时，常造成不良后果[1]。

目前，腹痛主要通过镇痛、抗感染、维持水/电解质和酸碱平衡等方法进行治疗，严重时可采取手术。这一系列治疗方法虽然临床疗效尚可，但存在一定的局限性。尤其是近些年随着抗生素的滥用导致耐药率的增加。同时，在处理不能耐受手术等有创操作的患者时，治疗效果欠佳[2]。既往研究表明，中医药在治疗危急重症以及慢性腹痛方面大有可为。多种方剂或者中成药能有效治疗急、慢性腹痛，且患者获益较多。沉香具有行气止痛的功效，但关于沉香治疗急、慢性腹痛的研究报道较少，尤其缺乏药物的生物功能研究。因此，本研究针对单药沉香的有效成分，结合当前生物信息学方法，探讨其治疗腹痛的靶点分子，并进一步预测可能涉及的功能以及生物信号通路。

1 方法

1.1 中药有效成分和靶点预测、注释

采用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)对沉香的有效成分进行筛选。本研究中涉及的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30；类药性(drug-likeness，DL)>0.18。筛选成份后在此网站进行疾病靶点的预测。并将以上所得结果导出，备用。在获得上述靶点以后，采用Perl语言对靶点基因identification(ID)进行转换，并通过Uniprot 数据库(http://www.uniprot.org/)比对，获得GeneSymbol。

1.2 疾病靶点预测

本研究针对腹痛分别检索了2个数据库，GeneCards (https://www.genecards.org/)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://omim.org/)。

1.3 药物靶点与疾病靶点比对

基于以上两步分析，分别获得药物的靶点分子和疾病的靶点分子。疾病(腹痛)和药物(沉香)联合，将以上获得的两个靶点分子求交集，并采用R语言“VennDiagram”包绘制韦恩图。进一步采用Cytoscape软件，将中药网络药理可视化呈现。

1.4 蛋白互作网络以及富集分析

为进一步探讨药物的生物学功能，本研究将已经交集化获得的靶点带入STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=rXdZZCcF2Y5a &input_page_show_search=on)进行蛋白互作网络分析(protein-protein interaction network，PPI)。主要参数设置为：minimum required interaction score: highest confidence (0.900)。所得核心基因的PPI采用Cytoscape软件进行可视化呈现。

富集分析主要涉及生物学功能以及通路分析。两者分别通过The Gene Ontology (GO, https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)以及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG, https://www.kegg.jp/)分析完成。富集分析的结果采用R语言“clusterProfiler”包可视化呈现。

1.5 统计学方法

此次研究涉及的数据均采用R语言以及生物信息网站自带统计功能进行运算。基因、通路等筛选过程中，均以校正后P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉香有效成分和靶点预测、疾病靶点预测

共筛选出符合要求的沉香有效成份8个，疾病相关靶点214个，药物相关靶点87个。以沉香和腹痛作为中介，求交集后构建沉香主要成分-靶点-疾病核心网络，共筛查到69个基因与疾病和药物均有联系。本研究对单药有效成分的参数主要涉及相对分子量(molecular weight，MW)、脂水分配系数的对数值(AlogP)、氢键供体(Hdon)、 氢键受体(Hacc)、 OB、肠上皮渗透性(Caco-2)、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)、类药性(drug-likeness，DL)、负表面积(FASA-)以及药物半衰期(half life，HL)，具体结果见表1。药物与疾病靶点交集的韦恩图见图1A，药物、有效成份、症状及共同作用的靶点网络体系见图1B。

表1 基于TCMSP数据库沉香单药的有效成分预测

2.2 PPI以及富集分析

根据沉香主要成分-靶点-疾病核心网络共筛查到69个基因，将这69个基因带入STRING数据库，构建PPI网络(图2A)。为进一步从PPI中获取核心基因，我们对蛋白之间的相互联系进行计数。与其他蛋白连接数量最多的分别是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)(12次)、CCND1(11次)、ESR(11次)以及RELA(10次)(图2B)，这些蛋白对应的基因与其他基因相比，基因之间的相关性更多，其功能在网络中可能扮演核心基因的作用。

注：A：药物有效成分的靶点预测与疾病相关靶点预测的韦恩图； B：沉香的有效成分、作用靶点以及药物靶点的网络关系图图1 沉香有效成分和靶点预测、疾病靶点预测

注：A：基于STRING数据库结果，Cytoscape进一步构建的PPI网络图； B：蛋白之间的相关连接数量图2 成分-靶点-疾病核心网络所涉及69个基因的PPI网络图

利用DAVID(https://david.Ncifcrf.gov/) 网站对成分-靶点-疾病核心网络所涉及的69个基因功能进行富集分析。结果发现，69个基因分别富集在100个功能上，其中Count数排前十的GO详见表2。分别为：①转录因子活性(transcription factor activity)，RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合(RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding)；②DNA结合转录激活活性(DNA-binding transcription activator activity)，RNA聚合酶Ⅱ特异性(RNA polymerase II-specific)；③泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)；④泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)；⑤近端启动子DNA结合转录激活活性(proximal promoter DNA-binding transcription activator activity)，RNA聚合酶Ⅱ特异性(RNA polymerase II-specific)；⑥RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(RNA polymerase II transcription factor binding)；⑦蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)；⑧类固醇结合(steroid binding)；⑨激酶调节活性(kinase regulator activity)；⑩辅因子结合(cofactor binding)。R软件对其富集结果的可视化呈现见图3。

图3 成分-靶点-疾病核心网络所涉及69个基因的功能富集结果

表2 核心基因的功能聚集(Count数排前十的ID)

进一步对成分-靶点-疾病核心网络所涉及69 个基因的功能进行 KEGG 通路分析。在通路富集分析中，根据 FDR值筛选出 Top 5条信号通路(见图4)。具体的通路结果详见表3。分别为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、内分泌抵抗(endocrine resistance),铂抗药性(platinum drug resistance)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)以及MAPK信号通路 (MAPK signaling pathway)。

表3 核心基因涉及的信号通路

图4 成分-靶点-疾病核心网络所涉及69个基因的KEGG通路富集结果

3 讨论

腹痛是临床常见的症状，也是促使患者就诊的重要原因。腹痛多由腹内组织或器官受到某种强烈刺激或损伤所致，也可由胸部疾病及全身性疾病所致。此外，腹痛又是一种主观感觉，腹痛的性质和强度，不仅受病变情况和刺激程度影响，而且受神经和心理等因素的影响。即患者对疼痛刺激的敏感性存在差异，相同病变的刺激在不同的患者或同一患者的不同时期引起的腹痛，在性质、强度及持续时间上有所不同。临床急性腹痛常见于腹腔内脏器疾病、腹壁疾病、胸腔疾病以及全身性疾病，而慢性腹痛常见于慢性炎症、胃肠疾病、腹腔内脏器的扭转或梗阻、包膜张力增加以及胃肠运动功能障碍等。以往临床上通常会采用西医常规治疗，如止痛、抑酸以及手术等。但是多数研究显示，这些治疗方法(如采用质子泵抑制剂)可能提高肠道感染发生率，尤其是对部分年龄较大或病情较重的患者，更难以获得理想的临床疗效[3,4]。

沉香具有“行气止痛，温中止呕，纳气平喘”的功效，其在脾胃病领域主要用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆等症的治疗。既往有文献已经证实，沉香在治疗腹痛各种病症中的效果，最为典型的就是沉香止痛散在胃痛方面的应用[5,6]。此外，沉香化气丸以及复方陈香胃片等成药在胃溃疡的治疗中，也展现出显著的优势[7,8]。

现代药理学研究表明，沉香对多种消化系统疾病(如呃逆、胃溃疡、消化不良、便秘、肠梗阻等)具有多重疗效，其主要功能涉及镇痛、抗炎以及抗氧化等[9-12]。刘洋洋等[13]研究发现，沉香醇提物在肠推进、胃排空及抗胃溃疡方面均具有显著性作用。分析其原因可能与沉香具有“行气”、“温中”的作用，能舒畅气机、祛除寒邪有关，同时增强胃肠动力也可能是其中的原因之一[13]。另外，本研究发现成分-靶点-疾病核心网络所涉及69个基因的KEGG通路分别富集于为EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、内分泌抵抗、铂抗药性、ErbB以及MAPK信号通路。既往研究[14]发现，脾虚是溃疡发生和复发的根本因素，EGFR、局部炎性细胞因子浸润被认为是溃疡愈合重要的影响因素。ErbB信号通路参与了胃部多项生理功能，其信号转导的失调会导致胃溃疡甚至胃癌的发生和发展[15-23]。MAPK在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，是不同膜受体与细胞核之间联系最重要的信号途径[24]。上调MYC在人胃癌细胞中的表达，可抑制MAPK信号通路活化，进而阻滞胃癌细胞的迁移和侵袭[25]。

本研究通过中药网络药理学的方法，对沉香治疗腹痛作用机制进行了初步探讨。采用构建成分-靶点-疾病核心网络的方法筛选到69个基因。通过对这些基因进行分析，我们发现沉香治疗腹痛可能涉及的生物学功能。更重要的是，我们通过KEGG通路富集找到了相关的信号通路，这些通路中较为常见的ErbB以及MAPK信号通路与胃溃疡、胃炎以及胃癌等有密切的相关性。但是，本研究也存在一定的局限性。由于研究的数据均来自数据库，因此缺少临床研究数据作为佐证。另外，本研究采用网络药理学对药物的靶点预测，这种统计学的结果可能存在一定的假阳性，需要实验数据进行下一步验证。即便如此，随着生物信息学尤其是中药网络药理学的普遍应用，使得我们对常见药物(如沉香)的药理学研究有了更进一步认识。这为揭示沉香在治疗腹痛等相关疾病中涉及的分子机制提供了新的思路。