超声组织处理仪与水浴锅加热法对真菌六胺银染色效果的对比研究

宋子华 万维松 杨春蓉 王晓璐

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 病理科 & 三峡大学 病理学研究所， 湖北 宜昌 443003)

近年来由于各种免疫抑制剂、肿瘤化疗药物和糖皮质激素的广泛使用，使得真菌感染发病率不断上升，尤以肺部真菌感染居首位[1]。由于部分患者的症状和影像学表现缺乏特征性，病原体检测有助于患者的确诊和治疗[2]。通过HE染色法进行病理诊断往往耗时长且阳性率低。另外，尽管实时荧光定量PCR对于真菌检测敏感性高，但对实验室硬件要求高、费用昂贵且操作过程中易污染。因此在临床实践中，特殊染色对于诊断真菌感染仍然是经典方法。六胺银(periodic acid-silver methenamine，PASM)染色法是一种临床常用的重要特殊染色技术[3-6]。通过PASM染色观察曲霉菌和毛霉菌的菌丝有无分隔，分支的角度以及染色强度，有助于区别曲霉菌和毛霉菌[7]。但PASM染色受多种因素影响，本研究比较了目前临床工作中两种常用的PASM染色孵育方法在不同时间点对真菌染色的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年1月～2018年4月在我院病理科确诊的真菌感染病例标本。

1.2 试剂与仪器

试剂：六胺银试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司，内含高碘酸溶液、硼砂、六次甲基四胺银粉剂、硫代硫酸钠溶液，以及伊红染液。每次染色前，将其中一瓶硼砂溶液与一瓶六次甲基四胺银粉剂混合成一份工作液，即用即弃。仪器：全自动超声组织处理系统(型号HT-3)、HH-S2数显恒温水浴锅及立式染缸。

1.3 方法

①切片、烤片：同一标本分为两组，将石蜡包埋组织样本3 μm连续切片10张，烤片30 min；②脱蜡至水：在染缸内分别经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡5 min；无水乙醇Ⅰ处理1 min、无水乙醇Ⅱ、 95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇各处理30 s，流水冲洗3 min；③PASM染色：切片经高碘酸溶液氧化15 min，流水冲洗2 min后，分别放入经62℃预热工作液的全自动超声组织处理系统(型号HT-3)和HH-S2数显恒温水浴锅孵育5 min、10 min、15 min、20 min和30 min；流水冲洗2 min后置入硫代硫酸钠溶液处理3 min，流水冲洗2 min；④伊红复染：伊红染液复染30～60 s；⑤常规脱水/透明后中性树胶封固。

1.4 镜下判读标准

切片染色完毕后交由两名病理医师进行镜下观察并用双盲评分，评分采用林倩等[8]针对银球菌染色判读使用的十分制标准：①染色背景清晰；②菌体呈黑色；③荚膜或隔清晰透明；④细胞核或菌丝清晰；⑤周围组织呈淡棕色至棕色。上述5项指标若有不同程度的缺陷，则减0.1～2分。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，各组的评分结果采用均数±标准差表示。使用t检验比较两种染色方法之间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声组织处理仪组与水浴组的PASM染色评分

共收集78例真菌确诊病例的标本，其中曲霉菌60例、隐球菌15例、毛霉菌3例。分别使用超声组织处理仪和水浴锅对PASM染色标本62℃孵育，对两组切片孵育5 min、10 min、15 min、20 min、30 min的得分进行统计。结果显示，超声组织处理仪组PASM染色得分为9.23±0.25分，显著高于水浴锅组7.68±0.06分，差异均有统计学意义(均P<0. 01)，见表1。

表1 超声组织处理仪组与水浴组六胺银染色评分比较

2.2 两组在相同温度下不同时间的组织结构

经PASM染色后分别经水浴锅和超声组织处理仪62℃孵育5 min、10 min、15 min、20 min和30 min后的染色图片见图1。水浴组结果显示：62℃孵育5 min无阳性表达；10 min可见散在孢子阳性，但菌丝未见阳性；15 min可见孢子广泛阳性表达，菌丝表达弱阳性；20 min可见菌丝，孢子均广泛阳性表达，染色背景干净；30 min染色背景过强，掩盖了孢子，菌丝的表达。超声组织处理仪组结果显示：62℃孵育5 min孢子阳性，菌丝未表达；10 min孢子强阳性表达，菌丝弱阳性表达；15 min孢子和菌丝均强阳性表达，且染色背景干净；但孵育20 min和30 min则背景过强，掩盖了孢子菌丝的表达。两组不同孵育时间与染色效果对比见图2，结果提示PASM染色在超声组织处理仪62℃孵育15 min时显色最佳，而采用水浴法达到相同的染色效果则需要孵育20 min。

注： 62℃水浴孵育和超声组织处理仪孵育5 min、10 min、15 min、20 min、30 min的PASM染色效果(200×)，真菌菌丝呈棕褐色图1 两组在不同孵育时间的PASM染色效果

图2 两组不同染色时间与染色效果对比

3 讨论

PASM其原理是真菌经高碘酸氧化，使其胞壁内的粘多糖暴露出醛基后将PASM还原为黑色的金属银。因此，孵育的方法、温度和时间是PASM染色的关键[9]。超声波、微波和水浴等方法均能加强试剂对组织的穿透作用，但微波法不容易控制试剂的温度，组织标本温度过高会引起组织的收缩和硬化[10]。大多数实验室目前仍然沿袭传统的水浴锅对PASM真菌染色进行孵育。水浴加热是利用热传导的原理将热量从被加热物外部传入内部，均匀加热。要使中心部位达到所需温度，需要一定的时间。单一的水浴加热作用较弱、所需时间较长，掌控不好会使背景着色重而影响病理医师对结果的判读[11]。而超声组织处理仪在加热过程中应用空化效应动力学原理，当足够强度的超声波通过液体时，存在于液体中的微小气泡就会迅速增大，形成高温伴强大冲击波和时速达400 km的射流，能有效改善细胞膜的通透性，使被加热物本身成为发热体。此外其增温效应使分子间的运动加速，短时间内达到加热效果，提高试剂与细胞内水分子交换速度和渗透力，有效缩短加热的时间[12， 13]。通过内外同时加热可有效提高试剂对组织的渗透速度，且相比直接加热试剂可避免高温引起的组织收缩和蛋白变性[14-16]。用该原理将PASM染色液与组织切片反应，通过超声运动速度，促使真菌游离的醛基还原PASM的银离子，可实现快速染色[17]。

本研究比较了日常工作中较常使用的超声组织处理仪和传统水浴锅在相同的孵育温度下不同反应时间点对PASM真菌染色的效果。两者均是基于恒温加热原理进行工作，但各有优缺点。水浴锅的使用更为常见，经济实惠，但加热过程偏长。全自动超声组织处理仪短时间内就可以显示出孢子和菌丝的表达，孵育和染色的时间短且染色效果好，能满足临床病理诊断优质染色切片的要求，可使患者尽早得到诊断和临床治疗。本研究结果显示，PASM染色在62℃下超声组织处理仪孵育15 min时显色最佳，而采用水浴法达到相同的染色效果则至少需要孵育20 min，这较大的缩短了标本处理时间，与其他研究结果一致[18， 19]。通过比较78例标本染色结果发现，超声组织处理仪组的PASM染色得分为(9.23±0.25)分，显著高于水浴锅组(7.68±0.06)分，证明超声组织处理法的染色效果优于水浴加热法。此外，超声组织处理仪操作简单、可根据需要设置组织处理时间、试剂温度和超声波输出功率，可满足临床工作中的HE染色、特殊染色、免疫组化等多种检测技术的要求[20]。

本研究的不足之处在于纳入研究的真菌病例中绝大多数为曲霉菌(60例)，而隐球菌和毛霉菌例数较少(分别为15例和3例)。虽然我们在同一方法组内并未发现这3种真菌的染色强度存在明显差异，但由于隐球菌和毛霉菌样本含量较少，尚不能排除种属的差异可能导致染色效果不同。今后将扩大样本量，对同一方法组内3种真菌的染色效果进一步研究以评判不同类型真菌染色是否存在差异。

超声组织处理仪能够较为精确地控制PASM真菌染色的温度和时间，其染色效果优于水浴加热法，具有较高的应用及推广价值。