响应面法优化副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶工艺

胡盼盼

（1.吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033000；2.山西农业大学 动物医学学院，山西 晋中 030801）

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn）属于胡颓子科沙棘属乔木或灌木[1]，拥有耐旱、抗风沙的特点[2]，在我国沙棘资源占世界沙棘资源的90%以上[3]，因此我国有“沙棘王国”之称[4]。沙棘果实含有大量的超氧化物和维生素[5-6]，富含有人体所需的各种氨基酸[7]，以及沙棘黄酮[8]、亚油素、脂肪酸等活性物质，因此具有抗氧化[9]、抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等生物活性[10]。酸奶是在纯牛奶的基础上经过高温灭菌，加入发酵剂、白砂糖等辅料发酵后制成的味道酸甜和口感细腻的乳制品[11]，乳酸菌在发酵中会产生多种代谢物质，能调控肠道的菌群和渗透压[12]，有利于肠道的通畅，可缓解便秘，营养价值优于鲜奶和奶粉。近些年购买酸奶的人群数量不断增多，市场庞大，广受人们的喜欢。

目前沙棘的食用主要为鲜食、榨汁饮用等[13]，很少将沙棘用于酸奶的研制，因此优化沙棘酸奶的加工工艺，可以使其营养价值和功效得到最大程度的利用。实验室前期从新疆马奶酒中自行筛选分离鉴定得到副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L，该菌株具有良好的发酵性能[14]及生物活性，并且已经验证其菌体[15]、胞外多糖[16]、发酵液等具有免疫和抗肿瘤等功能。

本研究旨在在传统原味酸奶的制作基础上加入沙棘汁，以感官评分为响应值，通过单因素试验及响应面法优化副干酪乳杆菌M5L发酵制备沙棘酸奶的工艺，这不仅可以提高酸奶的营养价值，并且能丰富酸奶的口味，为开发功能性沙棘酸奶及相关乳饮料提供理论依据和工艺参数，对我国沙棘的深加工具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L：分离自新疆马奶酒中，由哈尔滨工业大学化学与化工学院保藏；新鲜沙棘：于每年九月份采摘自吕梁汾阳市城子沙棘种植基地；新鲜全脂牛奶：离石区赵家庄奶牛场；白砂糖（食品级）：市售。

1.2 仪器与设备

NLG380型电磁炉：舟山南菱电子科技公司；BSA224S型电子称：广东省精密仪器公司；BCD-98A128型冷藏柜：上海新飞欧品公司；ZHWY-200D型酸奶发酵箱：广州省恩时科技公司；BILONJJ-2型榨汁机：山东曲阜市鲁强机械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘酸奶制备工艺流程与操作要点

操作要点：选取新鲜沙棘为原料，摘下沙棘果洗净并除去杂质，然后进行压榨，之后用过滤布除去沙棘渣，得到澄清的沙棘汁并用保鲜膜密封备用。将沙棘汁、纯牛奶、白砂糖按比例调配，加热搅拌至沸腾并持续20 min，在超净工作台上降温。然后按比例添加发酵剂，搅匀密封，放置到42 ℃培养箱中培养8 h，发酵完成后及时取出，降至常温之后在4 ℃冷藏柜中放置12 h后进行感官评定和酸度值测定。

1.3.2 副干酪乳杆菌发酵制备沙棘酸奶的工艺优化

单因素试验：在白砂糖添加量为8%、发酵剂用量为1%的工艺条件下，以酸度和感官评分为评价指标，考察沙棘汁添加量（6%、9%、12%、15%、18%）对沙棘酸奶品质的影响。在此基础上，依次考察白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）和发酵剂添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）对沙棘酸奶品质的影响。

响应面试验：根据Box-Behnken试验设计，基于单因素试验结果，选取沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）及发酵剂添加量（C）为考察因素，以感官评分（Y）为响应值，应用Design-Expert 10.0进行优化试验，试验因素与水平见表1。

表1 沙棘酸奶发酵工艺优化响应面试验因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

1.3.3 分析测定方法

感官评定：根据中国乳制品工业行业规定RHB103《酸牛乳感官质量评鉴细则》[17]，选取颜色、口味、风味、组织形态作为产品评分的标准。挑选10名专业人员分别对成品酸奶进行打分（总分为100分），计算出10名人员得分的平均值即为该发酵酸奶的感官评分，其评分标准见表2。

表2 酸奶的感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of yoghurt

微生物指标：根据国家标准对酸奶的大肠杆菌[17]、乳酸菌数[18]以及致病菌[19-20]等进行测定。

理化指标：根据国家标准对酸奶的酸度[21]、蛋白含量[22]、脂肪含量[23]等进行测定。

2 结果与分析

2.1 沙棘酸奶发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 沙棘汁添加量对酸奶品质的影响

沙棘汁添加量对酸奶品质的影响见图1。由图1可知，沙棘汁添加量对酸奶的酸度影响较小，而随着沙棘汁添加量的增加，酸奶的感官评分呈现先增加后减小的趋势，当沙棘汁添加量为6%时，产品口味较淡，色泽较浅，因此感官评分较低为75分；当沙棘汁添加量为12%时，产品口感、颜色及风味最佳，感官评分最高，为90分；继续增加沙棘汁添加量则会因为沙棘味较重而掩盖酸奶原有风味，导致感官评分降低。因此，确定最佳沙棘汁添加量为12%。

图1 沙棘汁添加量对酸奶品质的影响Fig.1 Effect of sea-buckthorn juice addition on the quality of yoghurt

2.1.2 白砂糖添加量对酸奶品质的影响

白砂糖添加量对酸奶品质的影响见图2。由图2可知，白砂糖添加量对酸奶的酸度影响较小，而酸奶的感官评分随着白砂糖添加量的增加呈现先上升后下降的趋势。当白砂糖添加量为8%时，感官评分最高，为90分。当白砂糖添加量较小时，酸奶酸味太重，口感较差。当白砂糖添加量＞8%之后，又因甜味过重，酸奶特有香味减小，感官评分随之降低。因此，确定最佳糖添加量为8%。

图2 白砂糖添加量对酸奶品质的影响Fig.2 Effect of sugar addition on the quality of yoghurt

2.1.3 发酵剂添加量对酸奶品质的影响

发酵剂添加量对酸奶品质的影响见图3。由图3可知，随着发酵剂添加量的增大，由于乳酸菌数量不断增加使得酸奶酸度不断增加，当添加量＞1.0%之后，酸奶酸度不再变化，这可能由于乳酸菌数量过多，而营养物质有限，活菌量达到最大，产酸量稳定。副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶的感官评分随发酵剂添加量的升高呈现先上升后下降的趋势。当发酵剂添加量为0.8%时，酸奶的感官评分最高，为91分。发酵剂添加量较低，酸奶成型较差，风味较淡，但添加量不断增大后，营养物质大量消耗，酸度较大而导致酸奶风味苦涩，使得感官评分不断降低。因此，确定最佳发酵剂添加量为0.8%。

图3 副干酪乳杆菌添加量对酸奶品质的影响Fig.3 Effect of Lactobacillus paracasei addition on the quality of yoghurt

2.2 沙棘酸奶发酵工艺优化响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立及分析

副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶制作工艺优化响应面试验设计及结果见表3。

表3 沙棘酸奶发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

以感官评分为主要考察指标，应用Design Expert 10.0软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到以副干酪乳杆菌发酵酸奶感官评分（Y）为响应值，与影响因素沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵剂添加量（C）的二次回归方程：Y=91.40-0.63A+0.12B-0.75C+0.25AB-1.00AC+0.50BC-6.83A2-3.32B2-1.58C2。对该模型进行方差分析及模型系数进行显著性检验，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

续表

由表4可知，模型的P值＜0.000 1，极显著，失拟项的P值＞0.05，不显著，表示结果与实际符合。一次项C、交互项AC及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。模型的校正决定系数R2adj=0.982 6，说明此模型与数据拟合度很高，试验误差小，预测结果较好。3个因素对沙棘酸奶品质影响的大小依次是C（发酵剂添加量）＞A（沙棘汁添加量）＞B（白砂糖添加量）。

2.2.2 各因素交互响应面优化分析

应用Design Expert 10.0对试验结果进行分析，绘制响应面及等高线图，结果见图4。由图4可知，沙棘汁和发酵剂添加量的交互作用等高线为椭圆形，响应面不平缓，说明沙棘汁和发酵剂添加量对沙棘酸奶感官评分的影响显著（P＜0.05），白砂糖和沙棘汁、白砂糖和发酵剂添加量间交互作用的等高线接近圆形，响应面图比较平缓，说明影响不显著（P＞0.05），与方差分析结果一致。

图4 各因素间交互作用对沙棘酸奶感官评分影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score

2.3 最佳工艺条件的验证

由响应面优化得到沙棘酸奶的最优发酵工艺为沙棘汁添加量11.91%、白砂糖添加量8%、发酵剂添加量0.95%，预测的感官评分为91.49分。但是由于考虑到操作过程的可行性，将工艺条件调整为沙棘汁添加量12%、白砂糖添加量8%、发酵剂添加量1%。在此条件下进行验证试验，沙棘酸奶的感官评分实际值为91.33分，结果表明，响应面优化出的副干酪乳杆菌沙棘酸奶工艺参数是准确可靠的。

2.4 沙棘酸奶产品分析测定

2.4.1 感官评价

根据最优工艺条件制备的凝固型沙棘酸奶色泽呈现乳白色略带淡黄色，口感细腻、柔和，带有沙棘的清香，酸甜可口，组织状态均匀，无乳清晰出，无分层现象[24]。

2.4.2 微生物指标

沙棘酸奶中未检出大肠杆菌，乳酸菌活菌数为1.4×107CFU/mL，致病菌未检出，均符合国家标准GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的规定（乳酸菌活菌数≥1.0×106CFU/mL，致病菌和大肠杆菌不准检出）[25]。

2.4.3 理化指标

沙棘酸奶的酸度为83.0°T，蛋白质含量为3.6%，脂肪含量为2.9%，均符合国家标准GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的规定（酸度≥70.0°T、蛋白质含量≥2.3%、脂肪含量≥2.5%）[25]。

3 结论

本试验以感官评分为响应值，采用单因素及响应面法对副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶的工艺进行优化，得到最优发酵工艺为沙棘汁添加量12%，白砂糖添加量8%，发酵剂添加量1%。在此优化条件下得到的沙棘酸奶呈淡黄色，具有沙棘和酸奶清香味，酸甜适中，组织细腻，稳定性好、无乳清晰出，感官评分最高，为91.33分。并且产品理化指标和微生物指标均符合国家标准GB 19302—2010《发酵乳》的相关要求。副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶不仅具有沙棘和乳酸菌的特有的营养和风味，同时也为研发有价值的乳制品生产提供理论指导，对沙棘深加工的研究具有重要的意义。