顶空-气质联用比较不同产地金银花与山银花挥发性成分差异

郭慧玲，罗江南，熊耀坤，胡律江，徐梦甜，封传华，赵晓娟，刘欣（江西中医药大学，南昌 330004）

金银花（Lonicerae japonicaeflos，L.japonicaeflos）为忍冬科植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，山银花（Loniceraeflos，L.flos）为忍冬科植物灰毡毛忍冬（LoniceramacranthoidesHand.Mazz.）、红腺忍冬（LonicerahypoglaucaMiq.）、华南忍冬（LoniceraconfusaDC.）或黄褐毛忍冬（LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或带初开的花，均具有清热解毒、疏散风热的功效，主要用于温病发热、喉痹、热毒血痢、风热感冒等病症[1]。金银花和山银花中均含有挥发油类成分。目前已从金银花中发现的挥发油成分多达390种，其挥发油成分复杂多样，主要含有棕榈酸、亚油酸、二十九烷、十四酸甲酯等[2-8]；山银花挥发油类主要有芳樟醇、棕榈酸、亚油酸以及辛烯醇等[9-13]。目前使用顶空气相色谱分析测定金银花和山银花挥发性成分并进行比较的文献不多，基于挥发性成分可能和两者疏风散热功能主治有关联，因此，研究两者挥发油类成分的差异具有较大意义。

本试验采用顶空进样方法，分析金银花和山银花样品粉末，使用GC-MS对挥发性成分进行分离和鉴别[14]。比较金银花和山银花挥发性成分的含量与种类的差异，并结合聚类分析，对不同产区的金银花和山银花进行区分，为其质量评价提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 7697A自动顶空进样器、7890A 型气相色谱仪、5975C单四极杆质谱仪（安捷伦公司，美国）；Sartorius BT 224S万分之一天平。

山银花3批，经江西中医药大学邓可众副教授鉴定为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬的干燥花蕾或带初开的花；金银花8批（购于樟树市庆仁中药饮片有限公司），经江西中医药大学邓可众副教授鉴定为金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。产地及批号见表1。

表1 不同产地金银花与山银花药品信息Tab 1 Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos medicine information from different origins

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 GC条件 色谱柱：HP-5 毛细管柱型弹性色谱柱（0.25 μm×250 μm×30 m）；进样口：230℃；载气：氦气；恒流模式，流速：1 mL·min－1；分流比：50∶1；程序升温：初始40℃，维持5 min，5℃·min－1升至 60℃，3℃·min－1升至100℃，4℃·min－1升至250℃，维持2 min。

2.1.2 MS条件 电离方式：EI源；灯丝电流30 μL；离子源：230℃；接口：250℃；扫描范围50～550 amu。

2.1.3 顶空进样条件 分别精密称取各金银花和山银花药材粉末200 mg，装于20 mL顶空瓶中置于样品盘上。炉温150℃，针温165℃，传输线温度180℃，样品瓶保温时间15 min。

2.2 GC-MS检测结果

按“2.1”项下GC-MS条件测定样品挥发性成分含量，通过谱库NIST17.L检索，结合文献对化合物进行分析，总离子流图见图1和图2，共有化学成分及结构见表2和图3，采用面积归一化法测定其相对百分含量，结果见表3。

表2 共有峰化学成分Tab 2 Chemical component of the common peak

表3 不同产地金银花与山银花挥发性成分相对百分含量(%)Tab 3 Relative percentage of volatile components in Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different areas (%)

续表3

图1 山银花挥发性成分总离子流图Fig 1 Total ion current diagram of volatile components of Lonicerae flos

图2 金银花挥发性成分总离子流图Fig 2 Total ion current diagram of volatile components of Lonicerae japonicae flos

图3 金银花和山银花共有峰质谱图及可能结构Fig 3 Mass-spectrogram and structure of common peaks of Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos

共鉴定出86个化合物，其中共有成分8个，即糠醛、糠醇、苦杏仁油、二甘醇、2-吡咯-甲醛、苯乙醇、4H-吡喃-4-酮、γ-丁内酯，其中二甘醇相对含量最高（30.30%），其次为4H-吡喃-4-酮（18.57%）。不同产地山银花和金银花均存在特有成分。

山银花中S1、S2、S3分别鉴定出20、24、27个成分，其中S1以二甘醇（30.30%）、糠醛（6.95%）、糠醇（15.89%）、4H-吡喃-4-酮（18.57%）含量较高，吡咯（1.22%）、甲基吡嗪（1.27%）为其特有成分；S2以（3R，6S）-2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-吡喃-3-醇（58.34%）、糠醛（5.37%）含量较高，二氢猕猴桃内酯（0.22%）、3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇（2.30%）、芳樟醇（1.97%）等成分为其特有成分；S3以二甘醇（21.72%）、糠醛（7.99%）、糠醇（7.89%）、4H-吡喃-4-酮（19.60%）、2，3-丁二醇（6.46%）含量较高，环丙基甲酮（0.51%）、1，4-丁烯二醇（0.38%）、对乙烯基愈创木酚（1.35%）、吡嗪酰胺（0.80%）为其特有成分。

金银花S4～S11样品分别鉴定出32、26、36、40、25、32、29、27个成分，8批金银花中均以二甘醇、糠醛、糠醇、4H-吡喃-4-酮含量较高。S4以羊脂酸（1.06%）、羊油酸（1.18%）等为其特有成分，S5以11-癸基-二十二烷（8.76%）为其特有成分，S6中特有成分包括喹啉（0.26%）、N，N-二-苯甲酰氧基-环丁烷-1，1-二甲酰胺（0.53%）、甲基环戊烯醇酮（0.27%）、1、2-氨基吡啶（0.27%）、吡嗪（0.38%）、14-甲基-十五烷酸甲基酯（1.04%），S7以（Z，Z）-1，3-环辛二烯（0.34%）、2-戊炔-1-醇（0.95%）、辛醛（0.44%）、7，10-十八碳二烯酸甲基酯（0.36%）、戊醛（2.10%）为其特有成分，S8中特有成分有甘油（0.51%）和环庚二烯酮（0.56%），S9中特有成分为甲基丙烯醛（1.11%）、E-2-庚烯醛（0.89%）、1-碘-三十烷（3.78%）、N-氧代吡啶（1.13%），S10以（2S，3S）-（＋）-2，3-丁二醇（1.69%）、2-乙基-3-乙烯基噁丙环（0.89%）、1，3，6-庚三烯（0.27%）为其特有成分，S11中特有成分分别为2-丙烯基-肼（0.58%）、二磷酸二异辛基酯（0.78%）、2，6-二（1，1-二甲基乙基）-4-甲基苯酚甲基氨基甲酸酯（0.45%）。

2.3 挥发性成分种类及相对含量

金银花和山银花中挥发性成分主要为脂肪族化合物，芳香族化合物和杂环化合物占有一定比例。脂肪族化合物包括酸类、酯类、醇类、酮类、醛类及烃类，共检测出4种酸类化合物，10种酯类化合物，9种醇类化合物，12种酮类化合物，8种醛类化合物，7种烃类化合物，6种芳香族化合物，其他主要为杂环、含氮等化合物；醇类化合物的相对含量最高（38.32%～71.13%），其次为酮类和醛类化合物（23.66%和13.74%），结果见表4。

表4 不同产地金银花与山银花中挥发性成分种类及相对含量(%)Tab 4 Type and relative content of volatile components in Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different areas (%)

金银花和山银花中挥发性成分种类及相对含量上有差异。金银花中酸类化合物种类较多，山银花中仅一个样品检测到棕榈酸，且其含量较低。金银花中酯类化合物种类及相对含量均高于山银花。山银花中醇类化合物数量较多，其中芳樟醇、辛烯醇在金银花中未被检测到，二甘醇含量以山银花较高。金银花中酮类化合物种类较多，山银花中则少数酮类含量高于金银花。烃类和芳香族化合物主要存在于金银花中，种类多于山银花；含量上金银花中烃类较高，山银花中则芳香族化合物较高。

2.4 聚类分析

以11批样品共有成分相对百分含量为基准，采用组间联结的方式，以平方Euclidean距离为测度，对不同产地金银花和山银花进行系统聚类分析，得到聚类树状图（见图4）。可知，当类间距为5时，可将11批金银花和山银花样品分为4类，S2分为第Ⅰ类，S9和S11分为第Ⅱ类，S1分为第Ⅲ类，S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10分为第Ⅳ类。11批样品中，第Ⅰ类S2中各个成分含量均低于其他样品，差异较大，故S2为一类；第Ⅱ类聚集了S9和S11，两个样品的二甘醇含量分别为41.97%和43.87%，含量远高于其他样品，其他成分含量相近，故聚为一类；第Ⅲ类为S1，其糖醇、吡咯-2-甲醛、苯乙醇、4H-吡喃-4-酮的含量较其他10批样品高，故分为一类；第Ⅳ类聚集了S3、S7、S10、S4、S5、S6、S8，S7和S10中二甘醇和4H-吡喃-4-酮的含量与S9和S11差异较大，S3中苦杏仁油含量最高，但与其他样品含量差异不明显，其他成分含量与其他样品含量差异不明显，故聚为一类。

图4 不同产地金银花和山银花聚类分析Fig 4 Cluster analysis of Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different area

3 讨论

3.1 条件优化

对样品质量、顶空温度、保温时间等条件进行了优化。考察100、150、200、250、300、500 mg顶空装样量对分离的影响，发现进样200 mg的分离效果比其他质量分离效果较好，色谱较全且稳定，质量过小或过大时，易造成顶空预热不均匀或粉末层太厚挥发性成分不易挥发。考察60、90、120、150、180℃顶空温度对分离的影响，发现在150℃时，挥发性成分的数量达到最高，当温度过低时，挥发性成分无法挥发出来进入检测器；但温度过高时，部分挥发性成分发生热降解。考察样品保温时间5、10、15、20、25 min对分离的影响，当保温时间为15 min时，分离效果较好。对色谱程序升温条件进行了调整，得出最佳色谱条件。

3.2 山银花与金银花挥发性成分的差异

不同产地金银花和山银花挥发性成分的种类及含量存在差异，共有成分的相对含量也不同。金银花中的酸类、酯类、酮类、烃类、芳香族化合物及其他类成分的种类均高于山银花，醇类物质则山银花中种类更多；金银花中的酯类、酸类、烃类在含量上高于山银花，醇类、酮类、芳香族化合物则低于山银花；金银花中特有成分的种类及数量均高于山银花。

棕榈酸、烟酸甲酯、棕榈酸甲酯普遍存在于金银花中，棕榈酸是已知的具有较强生物活性的物质，具有较强的抑菌[15]、抗氧化[16]、抗细胞凋亡作用[17]；棕榈酸甲酯被称为天然保护剂，对异丙肾上腺素引起的心肌损伤具有保护作用[18]，且可作为佐剂增加索拉非尼的抗肿瘤作用[19]。

结合聚类分析对金银花和山银花进行分类，将不同产地的金银花和山银花进行了区分。结果河南金银花被归为一类，表明河南金银花挥发油含量总体上差异不大，由于采摘时间不同，可能导致其个别成分上的差异，金银花挥发性成分总体上要优于山银花。金银花和山银花中挥发性成分种类及数量均有较大的差异，表明不同产地、不同年份和不同采收时间均有可能对药材的成分产生影响，河南为金银花的道地产区，表明河南的生态环境更适合于金银花的生长。

中医应用芳香性药材时，是“取其气而不取其味”，“取其气”即利用药材中挥发性有效成分用于治疗疾病，金银花和山银花中含有挥发性成分，其挥发性成分是否具有药效作用，是否与功能主治中的“疏风散热”有关联，这也是后续研究的主要方向。鉴于本研究中各个产区样本数较少，在后续研究中还需继续增加采集地区与样品批次，进一步完善金银花和山银花的鉴别研究，为金银花和山银花的质量评价提供科学依据与参考。