云南某肉鸡场滑液囊支原体血清学及病原学诊断

2021-07-02张敬寒刘宇权刘艳丽张以芳邹丰才

现代畜牧兽医 2021年6期

陶杰，张敬寒，徐思，刘宇权，刘艳丽，张以芳，邹丰才，柴俊*

（1. 云南农业大学动物医学院，云南昆明650201；2. 墨江县动物疫病预防控制中心，云南墨江654800；3. 墨江县畜牧工作站，云南墨江654800）

禽支原体感染在世界上分布广泛，鸡群中感染水平较高，常见的有鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体。近年来，鸡滑液囊支原体发病率呈上升趋势[1]，是由鸡滑液囊支原体（Mycoplasmasynoviae，MS）感染引起，以跗关节渗出性的滑液囊膜炎和腱鞘滑膜炎为特点的慢性或急性传染病[2]。各品种鸡均易感染，以雏鸡为首。流行病学调查显示，在东欧、荷兰、墨西哥、阿根廷均存在MS 感染[3-4]；美国商品蛋鸡普遍感染[5]；西欧弗兰德斯地区感染率达76.3%[6]。MS 一年四季均会发生，春、冬两季比较常见，主要传染源是病鸡或存在隐性感染的鸡[7]。MS 可以通过种鸡蛋进行垂直传播，也通过饲养人员携带、饮用水污染等因素进行直接或间接的水平传播[8]。不同菌株的感染对鸡致病性不尽相同[9]，能够引起不同程度的亚临床型上呼吸道感染、关节炎和传染性滑膜炎，使鸡的生长发育缓慢、鸡肉品质下降，严重时会引起鸡免疫系统的抑制[10]。鸡场一旦发生该病，很难根除，给养殖场带来难以估量的损失。现有云南昆明某鸡场中的鸡出现陆续瘫痪死亡，部分鸡喜卧、站立不稳、脚垫增厚、跗关节明显肿大（飞节和趾节较为严重）、用手触摸有波动感，诊断疑似为MS 感染。本试验通过病鸡的临床症状诊断、病理组织剖检、血清平板凝集试验、PCR 检测、基因序列比对和同源性分析进行综合诊断，最终确诊为MS 感染，为进一步防控和净化鸡滑液囊支原体病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2019 年12 月采自云南昆明某肉鸡养殖公司具有MS典型症状的病鸡样品3只。

1.1.2 试剂及耗材

TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2xEasyTaq PCR SuperMIX（tdge）均购自北京全式金生物技术有限公司。阳性参考菌株、滑液囊支原体平板凝集试验抗原、阳性血清均购自中国兽医药品监察所。

1.2 试验方法

1.2.1 血清平板凝集试验

参照GB/T 17999.4—2008《血清平板凝集试验》要求进行样品的血清平板凝集试验。

1.2.2 引物的合成

根据GenBank 中公开发表的MS 的基因序列，利用Oligo7设计1对引物，MS-F引物：AAATCAGGCTCGGGC CCT，MS-R 引物：AGTAACCGATCCGCTTAATGC，扩增片段374 bp，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

1.2.3 病料采集及DNA提取

无菌采集肿胀关节腔内的关节液渗出物和内容物、胸部龙骨旁干酪样坏死物和增厚脚垫内容物，黏液用生理盐水稀释。按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 使用说明书提取DNA，共提取3 份DNA。

1.2.4 PCR检测

利用MS 检测引物MS-F、MS-R 对上述提取的DNA进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系 25 μL：2×Easy TaqSuperMix（tdge）12.5 μL、sterile ddH2O 9.5 μL、上下游引物各 1 μL。1 号加 1 μL 阳性菌株 DNA；2 号加 1 μL 的ddH2O；3、4、5 号各加入 1 μL 的 DNA 模板。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后把PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统上观察结果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。

1.2.5 测序和核苷酸同源性分析

将胶回收产物送至昆明擎科生物科技有限公司进行测序。测序的结果在NCBI 数据库中进行比对，使用DNAStar 软件，对 3 株分离株（YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019）与 GenBank 中的 16 株 MS 参考毒株进行16S rRNA 核苷酸序列同源性分析。参考毒株信息见表1。

表1 参考毒株信息Tab.1 Reference strain information

2 结果与分析

2.1 病鸡临床症状和病理变化（见图1）

图1 病鸡病理变化Fig.1 Pathological changes in sick chickens

对病鸡进行抗生素治疗，效果不明显，发病数量仍在增加。询问免疫程序，1日龄接种马立克病疫苗；4日龄接种传染性支气管炎疫苗；7、21 日龄接种新城疫疫苗；14、28日龄接种法氏囊疫苗。

所观察的鸡为2 只土杂鸡、1 只瑶鸡。由图1 可知，临床症状为病鸡鸡冠轻微萎缩呈苍白色、羽毛混乱、消瘦脱水、常缩头闭眼、行走时步态蹒跚；跗骨关节肿胀变粗（飞节和趾节较为严重）、用手触摸有波动感、脚垫增厚严重、行走的姿态呈轻微的八字步、胸部的皮下组织发生肿胀。

病理变化：剖检病鸡肿胀的关节和脚掌末端，发现有大量黏稠的黄色脓液的流出、胸部触摸明显增厚、有坏死灶形成；剖检病鸡的腺胃，发现里面基本没有内容物、看不到明显的病理变化、脾肾等器官正常；剖检病鸡的气管未发现出血点，只有少量黏液。

2.2 病鸡血清平板凝集试验结果（见图2）

由图2可知，经过血清平板凝集试验检测，3份血清阳性率为100%。

图2 病鸡平板凝集试验结果Fig.2 Plate agglutination test results in sick chickens

2.3 PCR扩增结果（见图3）

由图3可知，在374 bp位置可见清晰、明亮的特异性条带，与预期条带相符。

2.4 同源性分析结果（见图4）

图3 PCR产物电泳结果Fig.3 The electrophoresis result of PCRproduct

对分离株 YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019 与GenBank 中的16 株参考毒株进行序列同源性分析。由图5 可知，YNKM1-2019 与16 株参考序列同源性为94.2%~99.6%，其中与MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 的同源性最高，为99.6%，与K870-KJ606930 的同源性最低，为94.2%。YNKM2-2019 与16 株参考序列同源性为94.2%~100%，其中与YNKM3-2019 的同源性最高，为100%，与K870-KJ606930 的同源性最低，为94.2%。YNKM3-2019 与16 株参考序列同源性为94.2%~99.6%，其中与MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 四株的同源性最高，为99.6%，与K870-KJ606930 的同源性最低，为94.2%。

图4 同源性分析结果Fig.4 Homology analysis results

3 讨论

近年来，云南省内MS发病率较高，但对本病的病原分离鉴定和相关研究较少。目前还未研发出针对性的药物，不能根除该病，只能控制鸡群感染率，降低发病率[11]。MS感染确诊的方法有病原分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法等。病原分离鉴定可靠性较高，培养后分离细菌进行瑞士染色，在油镜下和培养基上观察形态来确定[12]。血清学诊断常用的有血清平板凝集试验、血凝抑制试验、酶连免疫吸附试验等[13]。临床中常用PCR检测法，该方法特异性强、敏感性高、耗时短、操作简单、准确性高[14-15]。为确保试验结果的准确性，最终需要使用多种检测方法来确诊。

本研究采用血清学方法和病原分离鉴定对云南昆明某肉鸡场疑似感染MS的病鸡进行诊断。首先进行血清平板凝集试验，结果3份病料样品均为阳性；然后从特征性病理变化的肿胀关节内容物中提取DNA 进行PCR 扩增，扩增产物电泳结果显示，在374 bp 处有清晰的特异性条带；最后将PCR产物回收后进行测序，结果与Genbank中下载的16条参考序列进行比对，再通过同源性分析发现其同源性在94.2%~99.6%之间，确诊为MS。