饲用黄丝藻粉对大鼠两代繁殖毒性及致畸试验

2021-07-02肖金吒陈玢霖王存凯周志强丁丽军张雨梅

现代畜牧兽医 2021年6期

肖金吒，陈玢霖，王存凯，周志强，刘娟，陈新，2，丁丽军，张雨梅，2*

（1. 扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；3. 江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

黄丝藻为黄藻纲、黄丝藻属藻类，多在淡水环境中生长。在27 种黄丝藻属中，我国有16 种及2 个变种[1]。黄丝藻是一种节状不分支丝状微藻，单节细胞长7~20 µm、宽3~1.5 µm，藻丝长度为0.5~3.0 mm[2]。目前，已有关于藻粉或藻粉提取物作为饲料成分或饲料添加剂的报道[3-4]。研究和应用较多的藻类主要有螺旋藻、小球藻、雨生红球藻和杜氏盐藻[5-6]。对黄丝藻的研究大多为生态治理方面，而对其资源化利用的报道相对较少。黄丝藻油脂含量高、代谢产物丰富、易采收，具有极大的经济效益。研究显示，囊状黄丝藻脂肪酸包括豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸（EPA）等，其中棕榈油酸的含量最高[7]。黄丝藻脂肪酸组分中EPA 可占细胞内总脂肪酸含量的11.97%[8]。在14 种微藻研究中，黄丝藻纲代表种异胶藻脂肪酸组成以EPA 为主，高达 31.96%，居所测微藻之首，棕榈酸（16∶0）和（16∶1）（n-7）含量也较丰富，PUFAs（n-3）的含量达32.93%[9]。黄丝藻ENN172 在优化培养6 d 后脂肪酸含量可达27.03%[10]，优化条件培养后的生物量提高32.73%，油脂产率提高16.74%，其脂肪酸产量仍具有很大的提升空间，有望成为微藻产业化养殖的潜力藻株。利用GC-MS 方法可检测到黄丝藻不同提取成分中含有9 种氨基酸、17 种有机酸、12 种糖类和 2 种醇[11-12]。收获微藻的成本一般占微藻类产品总成本约20%~30%[13]。小球藻属、栅藻属和杜氏盐藻属等单细胞微藻在培养或生产中较难收获，容易被原生动物吞食[14-15]。黄丝藻的特殊丝状体结构使其具有抵抗轮虫等原生动物和浮游动物吞食的能力，有助于微藻细胞的经济采收[16-17]。通过预处理的高活性黄丝藻藻种，降低其水分活度及含水量，在0 ℃密封环境中经36 h 长途运输过后，藻种活性达90%以上，脂肪酸、蛋白及多糖含量基本维持不变[18]。本研究中的黄丝藻粉为生产生物柴油后的废弃黄丝藻体，经适当处理后得到的藻粉。该藻粉中除了含有较多的粗蛋白、脂肪外，还含有较高水平的EPA。

研究通过对大鼠的两代繁殖毒性及致畸性试验，考察黄丝藻粉较大剂量、较长时间添加于饲料后对大鼠可能存在的不良反应，以期评估作为饲料应用的安全性，可为黄丝藻粉作为饲用产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄丝藻粉购自河北新奥生物技术公司（批号20180406），为草绿色粉末。粗蛋白含量37.2%、粗脂肪含量6.4%、EPA 含量1.46%。黄丝藻粉经粉碎后，过150 目筛，4 ℃密封保存备用。小鼠LD50≥5 000 mg/kg BW[18]。

试验Wistar 大鼠（清洁级）公、母各半，4 w，同性别体重差异不超过20%，由扬州大学比较医学中心提供。大鼠饲喂经60Co照射饲料，自由采食和饮水。试验前在实验动物房环境中适应5 d。

黄丝藻粉以10%、5%和2%添加至饲料中，由江苏协同医药生物有限公司加工制成饲料。

1.2 试验设计

黄丝藻粉以高、中、低剂量经饲料给予。对照组大鼠饲喂常规大鼠饲料，试验组饲喂含有10%、5%和2%的黄丝藻粉饲料。每组公鼠20 只、母鼠22 只。亲代及断乳子代接受的黄丝藻粉剂量相同，子代在断乳后给予。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 大鼠繁殖性能

在黄丝藻粉给予10 w后，按1∶1的比例随机选择雌鼠和雄鼠合笼交配，次日晨检查阴道栓，以见栓标记为受孕第0 d。受孕鼠分笼饲养，继续饲喂各组饲料。孕鼠的体重持续增加，则表示妊娠过程及胚胎发育正常。每组10只孕鼠待自然分娩后，记录每窝的产仔数、活仔数、死仔数、性别，计算生活仔率、出生存活率和哺乳存活率。按以下公式计算每组的受孕率、妊娠率、出生活仔率、出生存活率和哺乳存活率。

1.3.2 新生鼠的生长性能

新生鼠断奶后分为两部分，第一部分从每窝中随机抽出公、母鼠各2 只，使每组公、母鼠各20 只，饲喂相应剂量组饲料10 W 后，按1.3.1 中方法进行交配产生孕鼠。第二部分从每窝仔鼠中随机选出公、母鼠各1只，使每组公、母鼠分别10只，饲喂正常饲料，每周称量体重和饲料消耗，用于新生鼠生长情况的观察。

1.3.3 大鼠脏器与胎鼠畸形检测

在受孕第20 d，每组处死6~8 只F0 孕鼠，称量主要脏器。同时剖检公鼠，计算脏器系数。孕鼠剖检时，取出整个子宫称取窝重，并分别称量胎盘重，计数活产幼仔数、死胎以及吸收胎数。检查活产胎仔的性别，测量每仔的体长、体重和尾长，并按窝计算平均体重、体长和尾长。对胎鼠进行外观畸形、内脏畸形和骨骼畸形检查。分别按以下公式计算畸胎率、活胎仔平均畸形率、母体畸胎率、死胎率及吸收胎率。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 12.0进行t检验或χ2检验。

2 结果与分析

2.1 黄丝藻粉对大鼠繁殖性能的影响（见表1）

表1 黄丝藻粉对大鼠繁殖性能的影响Tab.1 Effect of Tribonema powder on reproductive performance of rats

由表1可知，与对照组相比，黄丝藻粉组妊娠率、受孕率、总仔数、出生活仔率、出生存活率、哺乳存活率及性别比均无显著差异（P>0.05）。

2.2 黄丝藻粉对F1、F2 代大鼠的生长性能的影响（见图1、图2）

图1 黄丝藻粉对F1、F2代大鼠体重的影响Fig.1 The effect of Tribonema powder on the body weight of F1 and F2 generation rats

由图1可知，黄丝藻粉低、中剂量组大鼠体重与对照组相当，高剂量组F1、F2 代大鼠体重稍低，但差异不显著（P>0.05）。由图2 可知，黄丝藻粉组大鼠采食量与对照组无显著差异（P>0.05）。

2.3 黄丝藻粉对大鼠脏器与胎鼠畸形的影响（见表2~表4、图3）

由表2可知，除中剂量黄丝藻粉组F2肾系数显著低于对照外（P<0.05），其余各剂量黄丝藻粉组肝、肾、脾、子宫、卵巢及睾丸的脏器系数与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。

图2 黄丝藻粉对F1、F2代大鼠采食量的影响Fig.2 The effect of Tribonema powder on the feed intake of F1 and F2 generation rats

由表3可知，与对照组相比，黄丝藻粉3个剂量组的窝重、窝仔数、胎盘重、胎仔体重、体长、尾长及性别比无显著差异（P>0.05）。

由表4可知，F1代胎鼠畸形检查中仅发现胸骨骨节有缺失（或发育不全）现象，未见其他畸形。黄丝藻粉不同剂量组的畸形率、畸胎率等指标，与对照组无显著差异（P>0.05）。F2代胎鼠畸形检查中，黄丝藻粉不同剂量组及对照组，均未见外观畸形及内脏畸形。

由图3可知，骨骼畸形检查中对照组、高剂量和低剂量组，均发现在第7~12肋骨延长线上有红色染色，但与肋骨分离，胸骨节有缺失（或发育不全）现象。

表2 黄丝藻粉对F0、F1、F2大鼠脏器系数的影响Tab.2 Effect of Tribonema powder on organ coefficient of F0,F1,F2 rats 单位：%

表3 黄丝藻粉对F0、F1代母鼠剖检情况的影响Tab.3 Effect of Tribonema powder on necropsy of F0 and F1 generation rats

表4 黄丝藻粉对F1、F2代胎鼠畸形的影响Tab.4 Effect of Tribonema powder on deformity of F1 and F2 generation rats

图3 F2代胎鼠骨骼畸形Fig.3 Skeletal deformities of F2 fetal mice

3 讨论

将藻类或其提取物作为饲料或者添加剂已经有广泛的报道，如螺旋藻[19]、小球藻、杜氏盐藻等。对黄丝藻的研究大部分是在水体治理方面[20-21]，而在饲用方面的研究报道较少。黄丝藻油脂含量高、代谢产物丰富且易采收，有研究报道丝状微藻黄丝藻是可以用于户外培养的优势藻种[22]，在作为饲料成分或饲料添加剂方面具有良好的应用前景。

两代繁殖毒性试验通过对亲代和子一代两代动物进行染毒，除可获得受试物对亲代动物生殖系统和行为作用的一般性资料，同时还可提供新生仔疾病、死亡、出生前后发育毒性等方面的基础资料[23]。本研究中，受试物黄丝藻粉各剂量组对F0、F1母鼠的繁殖能力、生产性能及对子代生长发育，均与正常对照组比较无显著差异，说明受试物无明显的繁殖毒性。对F1、F2 代胎鼠畸形检查结果表示受试物各剂量组无外观畸形和内脏畸形，仅发现少量的骨骼畸形，且畸形率与正常对照组无显著差异，说明受试物对大鼠无明显的致畸作用。

本实验室前期研究中，黄丝藻粉对大、小鼠的经口急性毒性LD50>5 000 mg/kg，根据世界卫生组织（WHO）关于外源化学物毒性分级标准，受试物可归为无毒级别物质对黄丝藻粉的亚慢性毒性试验表明，10%添加于饲料中给予大鼠90 d未发现有明显的损害作用[24]。小鼠精子畸形试验，黄丝藻粉致突变试验结果为阴性，在体内或体外、对生殖细胞或体细胞均无明显的致突变作用。通过黄丝藻粉对大鼠的两代繁殖毒性及致畸性试验，评估其作为饲料应用的安全性，可为黄丝藻粉作为饲用产品的开发利用提供依据。